[發(fā)明專利]瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610181822.3
• 申請(qǐng)日: 2016-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN105695601B
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江莉;蔡黎;張耀光;王真瑜;朱民;馬曉疆;吳寰宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6893
• 分類號(hào): C12Q1/6893;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

1.一種瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：混合引物組合、2×多重PCR預(yù)混液、多重PCR陽性參考、100bp分子量Marker，所述的混合引物組合包括引物序列為No.1～SEQ ID No.10的特異性嵌合引物和1條序列為SEQ IDNo.11的通用引物，所述的試劑盒在進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的循環(huán)溫度為58℃、62℃和68℃三個(gè)逐級(jí)遞增的退火溫度循環(huán)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的特異性嵌合引物分別為針對(duì)間日瘧、三日瘧、卵形瘧、惡性瘧4種瘧原蟲的18SrRNA基因的特異性區(qū)段設(shè)計(jì)的特異性引物，以及針對(duì)瘧原蟲屬的線粒體基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的特異性嵌合引物的每一條引物的3’端為序列特異性識(shí)別位點(diǎn)，5’端為一段21bp的無關(guān)序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的特異性嵌合引物包括：針對(duì)間日瘧的一對(duì)上下游引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2、三日瘧的一對(duì)上下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、卵形瘧的一對(duì)上下游引物SEQID No.5和SEQ ID No.6、惡性瘧的一對(duì)上下游引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8和瘧原蟲屬的一對(duì)上下游引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的10條特異性嵌合引物的使用濃度為0.05μM/mL，通用引物的使用濃度為0.25μM/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的2×多重PCR預(yù)混液包括2倍濃度的Taq DNA聚合酶及dNTP、Mg²⁺離子和PCRBuffer。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的擴(kuò)增反應(yīng)為95℃預(yù)變性5min；94℃15s、58℃20s、72℃20s，循環(huán)5次；94℃15s、62℃20s、72℃20s，循環(huán)10次；94℃15s、68℃20s、72℃20s，循環(huán)25次；72℃3min，10℃保持。