[發(fā)明專利]一種含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯(lián)泛素化蛋白及其提取方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610180003.7
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105777873B
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王立新;沈艷飛;趙金金
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/107;C07K1/14;A61K39/00;A61K39/39
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 鄭立發(fā)

本發(fā)明公開了一種含有碳氮鍵His?Vx3?eGFP蛋白?納米鋁共價偶聯(lián)泛素化蛋白及其提取方法和應(yīng)用，所述泛素化蛋白是由His?Vx3?eGFP蛋白和經(jīng)過修飾后的納米鋁，通過碳氮雙鍵形成偶聯(lián)物，然后偶聯(lián)物再與經(jīng)過處理后的腫瘤細(xì)胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所得α?Al₂O₃?His?Vx3?eGFP性質(zhì)穩(wěn)定，能夠大大提高泛素化蛋白的募集效果，簡化了實驗操作。此外，還克服了原有泛素化蛋白疫苗使用時添加佐劑的缺陷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯(lián)泛素化蛋白及其提取方法，屬于腫瘤疫苗技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康。治愈性切除手術(shù)或化療、放療是目前腫瘤病人首選的治療方法。臨床資料顯示，大部分腫瘤病人對化療、放療等治療不敏感，因此，腫瘤的臨床治療迫切需要新的方法和手段。腫瘤生物治療作為一種新的腫瘤治療策略，具有特異性強、毒副作用小等優(yōu)點，越來越受到人們重視。其中，以樹突狀細(xì)胞(DC)為載體的腫瘤疫苗目前已成為腫瘤生物治療的研究熱點。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤抗原不能有效呈遞給T細(xì)胞是導(dǎo)致免疫逃逸的重要原因。同時在荷瘤機體中，由于存在抗原遞呈細(xì)胞的功能低下甚至缺陷，特別是DC在數(shù)量和功能的改變，可造成腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。目前，基于DC的腫瘤疫苗被認(rèn)為是最有效的腫瘤疫苗之一，已開展大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗。DC疫苗功能的實現(xiàn)主要取決于兩部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是負(fù)載有效的抗原，抗原信息得以充分表達(dá)。然而，研究試驗中存在許多問題有待解決，包括DC來源、制備過程、DC的抗原負(fù)載、用量、使用頻度、免疫途徑和次數(shù)，以及如何更好的募集腫瘤抗原等成為目前關(guān)注的熱點。

pAPC(professional antigen pressing cell,專職抗原提成細(xì)胞)交叉遞呈的抗原多肽是誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)、而腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽是效應(yīng)細(xì)胞有效識別并殺傷腫瘤細(xì)胞的靶點。一方面，腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽主要來源于腫瘤細(xì)胞的短壽蛋白(平均半衰期約為10分鐘)；另一方面，pAPC交叉遞呈的抗原多肽主要來源于腫瘤細(xì)胞的長壽蛋白(經(jīng)自噬途徑降解)，兩者間可能存在著不對稱現(xiàn)象，因此，解決上述的不對稱性是腫瘤免疫需要解決的課題。如何充分利用腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的全部抗原信息，誘導(dǎo)能更有效識別腫瘤細(xì)胞的特異性效應(yīng)細(xì)胞是目前以“長壽蛋白”為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗所面臨的難題。

目前認(rèn)為抗原供者細(xì)胞主要有兩條蛋白降解途徑：泛素-蛋白酶體途徑和細(xì)胞自噬途徑。其中，泛素-蛋白酶體途徑主要由蛋白酶體降解處理泛素化短壽蛋白，短壽蛋白主要包括一些錯誤編碼、錯誤翻譯等產(chǎn)生的核糖體廢產(chǎn)品，半衰期僅為10分鐘。近年來發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞MHC I(major histocompatibility complex I，主要組織相容性復(fù)合體I)類分子直接遞呈的抗原肽有80％以上來源于短壽蛋白。泛素分子作為胞內(nèi)信號分子能以一種極其嚴(yán)密的方式標(biāo)記蛋白分子。泛素分子與靶蛋白或者另一個泛素分子偶聯(lián)的過程是由一系列分子調(diào)控完成的，這些分子有泛素活化酶(E1)，泛素交聯(lián)酶(E2)和泛素連接酶(E3)；最終使泛素分子偶聯(lián)到多肽鏈Lys殘基的ε-氨基或者末端氨基酸的最末端基團，隨后，另一個泛素分子會通過與前一個泛素分子的Lys48連接而形成泛素鏈。這種連接類型的泛素鏈在很大程度上是作為蛋白酶體識別的標(biāo)志。被泛素化的底物進入蛋白酶體后很快就被蛋白酶體所降解。

前期我們通過將一個人工構(gòu)建的泛素化蛋白結(jié)合蛋白(His-Vx3-eGFP)的基因序列導(dǎo)入大腸桿菌(DH5α)并誘導(dǎo)其表達(dá)，采用鎳離子層析的方法已得到泛素化蛋白并且具有顯著的抗腫瘤效果。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中雖然已經(jīng)有泛素化蛋白的研究，但是，仍存在以下問題需要解決，如將His-Vx3-eGFP偶聯(lián)納米鋁的反應(yīng)溫度較高(90℃)，該反應(yīng)溫度難以有效控制；偶聯(lián)后產(chǎn)物的證明方法復(fù)雜，需用共聚焦顯微鏡證明其偶聯(lián)效果；募集腫瘤細(xì)胞泛素化蛋白的能力有待進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容