[發明專利]一種含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯泛素化蛋白及其提取方法和應用有效
| 申請號： | 201610180003.7 | 申請日： | 2016-03-25 |
| 公開（公告）號： | CN105777873B | 公開（公告）日： | 2019-07-30 |
| 發明（設計）人： | 王立新;沈艷飛;趙金金 | 申請（專利權）人： | 東南大學 |
| 主分類號： | C07K14/00 | 分類號： | C07K14/00;C07K1/107;C07K1/14;A61K39/00;A61K39/39 |
| 代理公司： | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 鄭立發 |
| 地址： | 211189 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 含有 碳氮鍵 his vx3 egfp 蛋白 納米 共價 偶聯泛素化 及其 提取 方法 應用 | ||
1.一種含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯泛素化蛋白，其特征在于，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和經過修飾后的納米鋁，通過碳氮雙鍵形成偶聯物，然后偶聯物再與經過處理后的腫瘤細胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白；泛素化蛋白的提取方法，包括以下步驟：
(1)利用三乙氧基硅烷，對納米鋁顆粒進行修飾；修飾方法為：納米鋁與過量的三乙氧基硅烷室溫下攪拌反應，使三乙氧基硅烷與納米鋁上的羥基反應；
(2)將修飾后的納米鋁與戊二醛反應，使醛基連接至納米鋁，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通過生成碳氮雙鍵形成His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯物；
(3)培養腫瘤細胞，抑制泛素化蛋白的降解，經細胞裂解液處理，離心得上清液；抑制泛素化蛋白降解的方法為：培養的腫瘤細胞生長至80％，加入萬珂和氯化銨，加入量分別為160nmol/L-240nmol/L和25mmol/L-35mmol/L，干預腫瘤細胞14-18小時，抑制泛素化蛋白的降解；
(4)將步驟(2)所得共價偶聯物和步驟(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub。
2.權利要求1所述的含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)利用三乙氧基硅烷，對納米鋁顆粒進行修飾；修飾方法為：納米鋁與過量的三乙氧基硅烷室溫下攪拌反應，使三乙氧基硅烷與納米鋁上的羥基反應；
(2)將修飾后的納米鋁與戊二醛反應，使醛基連接至納米鋁，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通過生成碳氮雙鍵形成His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯物；
(3)培養腫瘤細胞，抑制泛素化蛋白的降解，經細胞裂解液處理，離心得上清液；抑制泛素化蛋白降解的方法為：培養的腫瘤細胞生長至80％，加入萬珂和氯化銨，加入量分別為160nmol/L-240nmol/L和25mmol/L-35mmol/L，干預腫瘤細胞14-18小時，抑制泛素化蛋白的降解；
(4)將步驟(2)所得共價偶聯物和步驟(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub。
3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述修飾后的納米鋁與戊二醛反應的條件為：常溫攪拌反應2h。
4.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述His-Vx3-eGFP蛋白是由以下方法制得：
復蘇轉化了His-Vx3-eGFP表達質粒的大腸桿菌，誘導其表達蛋白，采用鎳離子層析法提取所述His-Vx3-eGFP蛋白。
5.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述培養腫瘤細胞為按照常規方法培養。
6.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述共孵育為4℃共孵育過夜。
7.權利要求1所述的含有碳氮鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價偶聯泛素化蛋白在制備抗腫瘤疫苗中的應用。
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