[發明專利]一種尖吻蝮蛇凝血酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201610179525.5
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105586330B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 鄧沁;彭維;王永剛;吳忠
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年;黃開艷

本發明公開了一種高活性尖吻蝮凝血酶的制備方法。該方法將蛇毒粗品經超濾膜超濾后通過陰離子柱層析，以磷酸緩沖液洗脫后，再通過分子篩凝膠柱除熱源與脫鹽，最終得到高活性、高純度的凝血酶。本發明方法與現有技術相比具有以下優點：該方法適合大規模生產、操作簡單、效率高；制備的尖吻蝮屬凝血酶產品產率高達8％，純度高達99％以上，比活力不低于180U/mg。

技術領域

本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種尖吻蝮蛇凝血酶的制備方法。

背景技術

蛇毒是毒蛇毒腺分泌的一種成分復雜的液體，含有多種蛋白質、多肽、酶類和其它小分子物質，具有廣泛的生物活性，目前研究人員已從蝰科洞蝮蛇屬蝮蛇(Bothropsatrox)、長白山白眉蝮蛇等蛇毒中發現多種類凝血酶。

尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)，蝰科尖吻蝮屬，廣泛分布于中國華南地區。尖吻蝮蛇凝血酶(HaemocoagulaseAcutus，簡寫為Halase)是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化的一種類凝血酶。它通過水解纖維蛋白的Aα鏈，使纖維蛋白原降解為纖維蛋白單體。專利CN1218747公開了尖吻蝮蛇凝血酶Halase用作治療出血性疾病藥物的用途，藥理和毒理研究表明其具有較強的止血作用和極低的毒性。

專利CN100523185公開了一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制備方法，通過透析、兩步DEAE-SepharoseFF層析梯度洗脫和SephadexG25層析分離得到蛇毒類凝血酶，其純度為95％。

專利CN101812436公開了一種單肽鏈的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶及其制備方法,得率為0.028％。其工藝包含三次DEAE-SepharoseFF層析，其中前兩次使用酸性的低濃度NaCl-PBS溶液進行梯度洗脫，第三次層析使用堿性的低濃度NaCl-PBS溶液進行梯度洗脫。

專利CN101560510公開了一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶，通過在兩次DEAE-SepharoseFF中使用堿性NaCl-PBS溶液進行梯度洗脫，再采用透析或Sephadex-G25脫鹽制備得純度不低于95％的產品，得率為0.7％-0.8％。

專利CN102757948公開了一種低流速下通過兩次Sephadex-G75層析和一次DEAE-SepharoseFF層析制備出純度為97.5％的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的方法。

專利CN103160485公開了一種尖吻蝮蛇凝血酶-C，通過硫酸銨分級沉淀、兩次DEAE-SepharoseFF層析，最后以透析或Sephadex-G25脫鹽得到比活力不低于40U/mg、純度不低于95％的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。

現有的從尖吻蝮蛇蛇毒中提取純化尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的方法大多涉及長時間的透析且需多次換液，另外陰離子交換層析步驟往往要求線性洗脫或多步洗脫，存在方法復雜、效率不高等問題。

因此，有必要尋找一種簡單高效、可應用于大規模生產的分離純化工藝，制備出高活性的尖吻蝮蛇凝血酶。

發明內容

本發明目的在于提供一種尖吻蝮蛇凝血酶及其制備方法。該方法適合大規模生產、操作簡單、效率高；制備的尖吻蝮蛇凝血酶產品產率高，純度高達99％以上，比活力不低于180U/mg。

本發明提供的技術方法通過以下步驟實現：

(1)粗品澄清：以0.01M磷酸鹽緩沖液溶液(pH值為6.2～6.9)溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品制成蛇毒溶液，蛇毒溶液經孔徑0.45μm的微濾膜過濾，收集濾液；

(2)超濾除雜：將步驟(1)所得濾液經孔徑10NMWC超濾膜過濾，收集濾液；