[發明專利]一種尖吻蝮蛇凝血酶及其制備方法有效
| 申請號： | 201610179525.5 | 申請日： | 2016-03-25 |
| 公開（公告）號： | CN105586330B | 公開（公告）日： | 2019-04-02 |
| 發明（設計）人： | 鄧沁;彭維;王永剛;吳忠 | 申請（專利權）人： | 中山大學 |
| 主分類號： | C12N9/64 | 分類號： | C12N9/64 |
| 代理公司： | 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326 | 代理人： | 劉新年;黃開艷 |
| 地址： | 510275 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 蝮蛇 凝血酶 及其 制備 方法 | ||
1.一種尖吻蝮蛇凝血酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)粗品澄清：以濃度為0.01M、pH值為6.5-7.1的磷酸緩沖液，溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品，制成蛇毒溶液，蛇毒溶液經孔徑0.45μm的微濾膜過濾，收集濾液；
(2)超濾除雜：將所得濾液經孔徑10NMWC超濾膜過濾，收集濾液；
(3)將步驟(2)所得濾液用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱進行第一次層析，用含有0.05mol/L NaCl，濃度為0.01M，pH值為6.2-6.8的磷酸緩沖液洗脫，收集出峰組分，以孔徑為10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
(4)將步驟(3)所得濾液用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱進行第二次層析，再分別用含0.03mol/L和0.1mol/L NaCl，濃度為0.01M，pH值為7.2-7.8的磷酸緩沖液依次洗脫，收集0.1mol/L的洗脫峰流出液，以孔徑10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
(5)除熱原：將步驟(4)所得濾液用Superdex-75pg層析柱，用pH值為7.2-7.8的0.01M磷酸緩沖液層析洗脫，收集出峰組分；
(6)脫鹽：將步驟(5)所得濾液用Sepadex-G25層析柱，用注射用水洗脫，對已除熱原的上述組分進行脫鹽，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)粗品澄清：以濃度為0.01M、pH值6.8的磷酸緩沖液，溶解尖吻蝮蛇蛇
毒粗品，制成蛇毒溶液，蛇毒溶液經孔徑0.45μm的微濾膜過濾，收集濾液；
(2)超濾除雜：將所得濾液經孔徑10NMWC超濾膜過濾，收集濾液；
(3)將步驟(2)所得濾液用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱進行第一次層析，用含有0.05mol/L NaCl，濃度為0.01M，pH值為6.8的磷酸緩沖液洗脫，洗脫速度10ml/min，收集出峰組分，以孔徑為10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
(4)將步驟(3)所得濾液用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱進行第二次層析，再分別用含0.03mol/L和0.1mol/L NaCl，濃度為0.01M，pH值為7.5的磷酸緩沖液依次洗脫，洗脫速度20ml/min，收集0.1mol/L的洗脫峰流出液，以孔徑10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
(5)除熱原：將步驟(4)所得濾液使用Superdex-75pg層析柱，用pH值為7.5的0.01M磷酸緩沖液洗脫，洗脫速度20ml/min，收集出峰組分；
(6)脫鹽：將步驟(5)所得濾液使用Sepadex-G25層析柱，用注射用水洗脫，洗脫速度20ml/min，對已除熱原的上述組分進行脫鹽，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
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