[發明專利]驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白報告系統

在審

• 申請號: 201610178729.7
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105779497A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 張茂雷;劉明;李自強;薛權燦
• 申請（專利權）人: 廣州吉賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光 蛋白報告系統及其構建方法。

背景技術

內部核糖體進入位點(InternalRibosomeEntrySite，IRES)是一段核酸序列，能夠使蛋 白質翻譯起始不依賴于信使RNA5’帽子結構，可以起始RNA從中間開始翻譯蛋白質。一 般情況下，真核生物翻譯從mRNA的5’端開始，因為翻譯起始需要依賴于5’端的帽子結 構。內部核糖體進入位點通常位于RNA病毒基因組的5’非翻譯區(UTR)，這樣病毒蛋白 的翻譯就可以不依賴于5’帽子結構。隨著研究的不斷深入在高等生物中也發現了不少基因 存在天然的IRES活性序列，在人類的基因組中陸續發現驗證很多基因RNA內部存在IRES 序列，并且具有重要的生物學活性，比如在常見原癌基因C-MYC基因內部存在的IRES活 性序列，重要的腫瘤抑制基因TP53內部也存在IRES活性序列。那么真核生物體內可能存在 很多沒有被發現的IRES活性序列，對于IRES的鑒定及活性研究有助于更加深入的揭示生物 科學的基本規律。

附圖說明

圖1是本發明的驗證內核糖體插入位點IRES序列活性的雙熒光蛋白報告系統表達框架。

圖2是利用本發明的雙熒光蛋白報告系統檢測IRES序列活性的結果。

發明內容

本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種能夠有效驗證內核糖體插入位點 IRES活性的雙熒光蛋白報告系統。

本發明的另一個目的在于提供上述雙熒光蛋白報告系統的構建方法。

為了實現以上目的，本發明提供了一種驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白 報告系統，所述雙熒光蛋白報告系統的表達框架的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

本發明還提供了一種用于驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白報告系統的構 建方法，該方法包括以下步驟：

(1)通過全基因化學合成，獲得如SEQIDNO：1所示的目標核苷酸序列；

(2)通過NheI和XhoI，將步驟(1)獲得的所述目標核苷酸序列連接到表達載體 pcDNA3.1(+)中。

作為一種優選的實施方式，所述步驟(2)中，采用PCR擴增的方法在設計引物的時候 引入NheI和XhoI酶切位點序列。

更優選地，所述引物的序列為：

primer-F0：5’–GCGCTAGCATGAAGGGCGAGGAGGATAAC-3’(SEQIDNO：3)

primer-R0：5’–CGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(SEQIDNO：4)

作為一種更優選的實施方式，所述PCR擴增的反應體系如下：PCR為50μl總體系：具 體是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各2μl，化學合成的基因框架SEQIDNO.1模板 1μl，用滅菌去離子水補足50μl體系；反應條件為：95℃5min預變性，循環內95℃30s變 性，60℃30s退火，72℃延伸1min30s，共35個循環，PCR反應循環后72℃繼續延伸7min， 然后4℃保存。

作為一種更優選的實施方式，將所述PCR擴增的產物回收純化，然后對其用NheI、XhoI 酶切后，同時pcDNA3.1(+)載體也用同樣的內切酶切割，然后將酶切后的PCR產物構建到 酶切后的真核表達載體pcDNA3.1(+)中。

本發明設計了一種由mCherry紅色熒光蛋白及GFP綠色熒光蛋白串聯的表達框架，紅色 熒光蛋白靠5’帽子結構起始翻譯。如果測試的核苷酸序列具有IRES活性，那么綠色熒光白 將會發出熒光作為報告熒光；如果目標序列沒有IRES活性，將沒有綠色熒光出現。最后可 以根據綠色熒光蛋白的熒光對內核糖體插入位點IRES活性進行有效的可視化檢測驗證。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步的詳述，但本發明的保護范圍 并不限于此。如未特別指出，本發明實施例中所用試劑、儀器均可通過現有技術獲得。

一、驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白報告系統表達框架的設計