[發明專利]驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白報告系統

在審

• 申請號: 201610178729.7
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105779497A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 張茂雷;劉明;李自強;薛權燦
• 申請（專利權）人: 廣州吉賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

1.一種驗證內核糖體插入位點IRES活性的雙熒光蛋白報告系統，其特征在于，所述雙 熒光蛋白報告系統的表達框架的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.權利要求1所述雙熒光蛋白報告系統的構建方法，所述方法包括以下步驟：

(1)通過全基因化學合成，獲得如SEQIDNO：1所示的目標核苷酸序列；

(2)通過NheI和XhoI，將步驟(1)獲得的所述目標核苷酸序列連接到表達載體 pcDNA3.1(+)中。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，采用PCR擴增的方法 在設計引物的時候引入NheI和XhoI酶切位點序列。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物的序列為：

primer-F0：5’–GCGCTAGCATGAAGGGCGAGGAGGATAAC-3’

primer-R0：5’–CGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系如下：PCR為50 μl總體系：具體是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各2μl，化學合成的基因框架SEQID NO.1模板1μl，用滅菌去離子水補足50μl體系；反應條件為：95℃5min預變性，循環內 95℃30s變性，60℃30s退火，72℃延伸1min30s，共35個循環，PCR反應循環后72℃繼 續延伸7min，然后4℃保存。

6.根據權利要求3至5任一項所述的方法，其特征在于，將所述PCR擴增的產物回收 純化，然后對其用NheI、XhoI酶切后，同時pcDNA3.1(+)載體也用同樣的內切酶切割，然后 將酶切后的PCR產物構建到酶切后的真核表達載體pcDNA3.1(+)中。