[發明專利]一種結核分枝桿菌單克隆抗體制備方法

在審

• 申請號: 201610178594.4
• 申請日: 2016-03-20
• 公開（公告）號: CN105732808A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 張福華
• 申請（專利權）人: 張福華
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及醫學領域，具體涉及一種結核分枝桿菌單克隆抗體制備方法。

背景技術

結核分枝桿菌俗稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌，可侵犯全身多種器官，嚴重威脅人類健康。

現有技術中針對結核分枝桿菌的檢測方法主要包括涂片法、培養法、噬菌體擴增法等，其中涂片法操作簡便且成本低廉，但是其敏感性低，且無法區分結核與非結核分枝桿菌，因此檢測結果易發生偏差。而噬菌體擴增法雖然在敏感性和特異性等方面具有優勢，但是其檢測周期較長、步驟較繁瑣且需要較苛刻的實驗條件，因此該方法推廣應用存在一定的局限性。而培養法是指將待測樣本接種至適宜的培養基，使其中的結核分枝桿菌(如果存在的話)擴增，而后檢測菌體本身或其代謝產物，該方法檢測時間較長且受環境影響較大，可重復性不佳。

近年來針對特定病原微生物的檢測試劑盒得到了廣泛的應用，多數基于抗原抗體反應，再配合相關顯色試劑，因此檢測較快且結果判別容易。現有技術中結核分枝桿菌檢測試劑盒的質量很大程度上由抗體性能所決定，一種敏感性強、結合速度快的抗體將有助于提升試劑盒的準確性和檢測速度。此外，由于導致人類患病的病原菌主要包括人型結核分枝桿菌和牛型結核分枝桿菌兩類，而這兩類病原菌的生物學特性相似性較強，現有技術的單克隆抗體普遍難以區分上述兩種分型。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種結核分枝桿菌單克隆抗體制備方法，以解決現有技術中結核分枝桿菌單克隆抗體不能單一的針對人型菌株。

本發明解決的再一技術問題是現有技術中結核分枝桿菌單克隆抗體效價較低。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種結核分枝桿菌單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：

1)取人型結核分枝桿菌菌液作為抗原，與弗氏完全佐劑乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同劑量抗原腹腔注射小鼠；

2)3天后，取上述小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞按5∶1的細胞量比混合在一支融合管中，1000rpm離心10min，混勻，在37℃水浴中45s內加入1mLPEG到融合管中，混勻，而后在90s內滴加30mL的DMEM培養基，37℃靜止10min，而后1000rpm離心10min；棄上清，用60mLHAT培養基懸浮沉淀細胞，再加入腹腔巨噬細胞，置37℃5％CO₂培養箱內培養；

3)利用間接ELISA檢測的方法，對步驟2)上清液中的抗體進行檢測，篩選出抗體陽性雜交瘤細胞；

4)取小鼠，以0.5mL/只的劑量腹腔注射滅菌液體石蠟，1周后以1×10⁶CFU/只的劑量對小鼠腹腔注射步驟3)得到的雜交瘤細胞，而后從小鼠腹腔采集腹水，離心取上清，即得到結核分枝桿菌單克隆抗體。

作為優選，步驟2)中所述的DMEM培養基是不完全DMEM培養基。

作為優選，步驟2)中置37℃5％CO₂培養箱內培養5d后用新鮮的HAT培養基換出一半培養基，10d后用預熱的HT培養基換出HAT培養基。

作為優選，步驟3)中用免疫小鼠血清作為陽性對照，用非免疫小鼠血清作為陰性對照。

作為優選，步驟3)篩選出抗體陽性雜交瘤細胞后，先制備其亞克隆細胞株，再利用所述亞克隆細胞株執行步驟4)。

作為優選，所述離心的操作條件是2500rpm離心10min。

本發明技術方案利用人型菌株制備出結核分枝桿菌單克隆抗體雜交瘤細胞株，其所分泌的抗體為只針對人型菌株，與牛型結核分枝桿菌均不發生反應，從而保證了該單抗體能夠專門針對人型血清型疾病。與此同時，本發明利用該株單克隆抗體的特性，建立ELISA方法和免疫膠體金的方法，其特異性和敏感性好?？捎糜谂R床檢測。此外，本發明制備的單抗體效價高、特異性較好，尤其適用于進一步制備人型結核分枝桿菌抗原診斷試劑盒或人型結核分枝桿菌抗原診斷膠體金試紙。本發明以創新性的技術改進實現了突出的技術效果，同時成本較低、易于實現，因此具有突出的推廣前景。

具體實施方式

以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。