[發(fā)明專(zhuān)利]一種非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗制劑的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610177771.7
• 申請(qǐng)日: 2016-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105767009A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉波;肖榮鳳;朱育菁;陳燕萍;史懷;葛慈斌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所
• 主分類(lèi)號(hào): A01N63/02
• 分類(lèi)號(hào): A01N63/02;A01P1/00
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林云嬌

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗制劑的生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】

由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的作物枯萎病是一種世界性 土傳病害，也是造成作物連作障礙的主要原因之一(劉波等，2013)。一般 造成10％-30％產(chǎn)量損失，嚴(yán)重者可導(dǎo)致絕收，及時(shí)有效防控成為茄科和瓜 類(lèi)作物安全生產(chǎn)的重大需求(Kaur等，2010；楊瑩瑩等，2012)。目前， 防治枯萎病的主要策略為化學(xué)防治和培育抗病品種，化學(xué)防治污染環(huán)境且危 害人類(lèi)健康，抗病品種培育困難且存在抗性減弱的風(fēng)險(xiǎn)，因此，有必要開(kāi)辟 更多的防治途徑。近年來(lái)，利用植物的免疫系統(tǒng)開(kāi)發(fā)安全、高效、無(wú)殘留的 “植物疫苗”研究成為了熱點(diǎn)。

隨著植物免疫學(xué)研究的持續(xù)與深入，研究者發(fā)現(xiàn)植物在長(zhǎng)期的演化過(guò)程 中，逐步發(fā)展了類(lèi)似于動(dòng)物的“免疫系統(tǒng)”來(lái)抵抗病害(Ausubel，2005)。 植物除了已具有的先天免疫的能力外，還可通過(guò)接種弱致病性或非致病性菌 株誘導(dǎo)其產(chǎn)生主動(dòng)抗病性，類(lèi)似于動(dòng)物的疫苗接種，激活植物的免疫系統(tǒng)和 生長(zhǎng)系統(tǒng)，提高作物自身免疫能力，從而增強(qiáng)植物抗病和抗逆能力(邱德文， 2008)。因此，利用生物誘導(dǎo)抗性的原理，開(kāi)發(fā)新型生物制劑“植物疫苗” 防治病害，符合“生態(tài)文明”要求，有助于增產(chǎn)、增收及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)提升。

非致病尖孢鐮刀菌是天然的植物疫苗菌株。已有部分研究報(bào)道其能促 進(jìn)作物生長(zhǎng)，并且能有效降低作物枯萎病的發(fā)生。Elmer(2004)研究表明， 提前接種非致病菌株CS-20，7d后接種致病菌，84d觀察發(fā)現(xiàn)菌株CS-20 能夠在蘆筍植株根部定殖，并可提高根部鮮重和減少根部病斑。Abeysinghe (2006)研究表明，提前接種非致病性尖孢鐮刀菌能顯著降低黃瓜根腐病與 莖腐病的發(fā)病率。楊猛等(2005)研究表明，提前在土壤中接種Fo47和 Fo47B10能提高黃瓜和西瓜植株的抗逆性和生長(zhǎng)發(fā)育，且對(duì)黃瓜霜霉病有明 顯的防治效果。錢(qián)曉雍等研究發(fā)現(xiàn)非致病性鐮刀菌IF23、251/2和MSA35 的接種濃度會(huì)影響番茄枯萎病的防治效果。

本發(fā)明所使用的菌株非致病性尖孢鐮刀菌菌株FJAT-9290是一株天然 的植物疫苗菌株，前期研究已表明，該菌株不會(huì)引起茄科、葫蘆科、芭蕉科 和百合科等作物發(fā)病，且在茄科、葫蘆科及芭蕉科等作物上具有良好的定殖 能力，可達(dá)40-90天。采用提前施用的方法能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且對(duì)番茄枯萎 病有較好的防治效果，其中盆栽防治效果為76.70％，田間小區(qū)防治效果為 69.56％，略高于化學(xué)農(nóng)藥50％多菌靈可濕性粉劑處理的防治效果68.64％(肖 榮鳳等，2015)。為本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)提供了菌株基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗 制劑的生產(chǎn)方法，其制備的植物疫苗制劑對(duì)作物有促長(zhǎng)、抗病的效果，可解 決番茄枯萎病難以防治的問(wèn)題，并達(dá)到減少化學(xué)農(nóng)藥使用的目的。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗制劑的生產(chǎn)方法，所述方法步驟如 下：

步驟(1)生產(chǎn)用液體菌種的制備：以非致病性尖孢鐮刀菌FJAT-9290 (Fusariumoxysporum)為菌種，以馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基和查氏酵 母培養(yǎng)液為液體菌種用培養(yǎng)基，制備生產(chǎn)用液體菌種；

步驟(2)非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗制劑的制備：以豬糞廢棄物為 主要成份制備植物疫苗生產(chǎn)的固體培養(yǎng)基物，與麩皮、麥粒混合后，分裝于 聚丙烯塑料袋中，滅菌后，接種步驟(1)所制備的液體菌種，28-30℃恒溫 培養(yǎng)發(fā)酵18-20天，制備植物疫苗固體發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵結(jié)束后將其拌勻， 即得非致病性尖孢鐮刀菌植物疫苗；

所述尖孢鐮刀菌FJAT-9290(Fusariumoxysporum)，于2012年3月 29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京 市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5910。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中生產(chǎn)用液體菌種制作步驟具體為：

步驟A.菌種的活化：配置PDA培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，冷卻至45 ℃倒于滅菌平板中，備用；取-70℃保存的非致病性尖孢鐮刀菌FJAT-9290 (Fusariumoxysporum)菌株于PDA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，28～30℃恒溫 培養(yǎng)5～7天；