[發(fā)明專利]一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標(biāo)探針和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610177383.9
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105695599A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方國偉;洪冉
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分子信標(biāo)探針，具體涉及一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分 枝桿菌的分子信標(biāo)探針和試劑盒。

背景技術(shù)

根據(jù)中國衛(wèi)生部組織的第四次全國結(jié)核病流行病抽樣調(diào)查(2000年)得出 的結(jié)果，我國有4億人感染過結(jié)核菌，現(xiàn)有的傳染性結(jié)核病人達(dá)200萬人，結(jié) 核病的人數(shù)位居世界第二，僅次于印度。耐藥結(jié)核病的發(fā)生和流行是當(dāng)今及今 后一段時間內(nèi)結(jié)核病防治工作的難題和最大挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展 和結(jié)核菌對抗結(jié)核藥物耐藥機(jī)制在基因水平的逐漸闡明，建立分子生物學(xué)的檢 測耐藥方法可提高檢測的速度。盡快初篩耐藥結(jié)核病人和制定最佳治療方案， 防止耐藥菌株在人群中的擴(kuò)散，降低原發(fā)性耐藥，是臨床上迫切需要解決的問 題。

利福平是主要的抗結(jié)核一線藥物，利福平通過與結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶 亞單位相結(jié)合，干擾結(jié)核分枝桿菌RNA的合成，從而達(dá)到抗菌的效果。結(jié)核分 枝桿菌RNA聚合酶亞單位由ropB基因編碼，95％以上利福平耐藥結(jié)核分枝 桿菌都與ropB基因的突變有關(guān)。

當(dāng)前臨床上檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌常用的方法有細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR 法。其中細(xì)菌培養(yǎng)法是檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法需要 進(jìn)行藥敏實驗，通常需要15-20天才能看到最終的檢測結(jié)果，檢測成本高、檢測 周期長；利用PCR方法可在短時間內(nèi)使特定的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增加， 有很高的靈敏度和特異性，但缺點(diǎn)是假陽性率高，另一方面，樣本中有往往含 有抑制PCR反應(yīng)的成分，這又會導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，這兩方面的缺點(diǎn)限制了PCR 檢測的臨床應(yīng)用。由此可見，利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的臨床診斷，急需 更簡潔、靈敏的檢測方法。

分子信標(biāo)探針(Molecularbeaconprobe)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、只有 和靶序列雜交上了才會發(fā)出熒光等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于熒光原位雜交。本發(fā)明通過 對大量利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌和非耐藥菌株的基因序列進(jìn)行比對，挑選利福 平耐藥結(jié)核分枝桿菌特有的基因ropB基因作為檢測靶點(diǎn)，并針對該靶位點(diǎn)設(shè)計、 合成三條分子信標(biāo)探針(BeaconROPB1,BeaconROPB2和BeaconROPB3)，通 過這三條探針的聯(lián)合作用，提高檢測的熒光信號強(qiáng)度，達(dá)到檢測利福平耐藥結(jié) 核分枝桿菌的效果。本發(fā)明還建立了穩(wěn)定的分子信標(biāo)原位雜交檢測利福平耐藥 結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)體系，克服了利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌當(dāng)前臨床檢測的諸 多問題，為利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的診斷、預(yù)防和控制提供新的檢測方 法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種快速檢測利 福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標(biāo)探針、試劑盒和方法。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝 桿菌的分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針包括BeaconROPB1、BeaconROPB2 和BeaconROPB3，所述BeaconROPB1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，所 述BeaconROPB2的堿基序列如SEQIDNO.2所示，所述BeaconROPB3的堿 基序列如SEQIDNO.3所示。

本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)或原理：熒光原位雜交(FlourescenceinsituHybridization， FISH)是一種應(yīng)用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的探針，通過雜交的方法來檢測細(xì)胞或組織 內(nèi)特異性DNA或RNA的方法；分子信標(biāo)探針是一種具有獨(dú)特“發(fā)夾”空間結(jié) 構(gòu)的探針，在未與靶序列結(jié)合時，分子信標(biāo)呈“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列(loop) 和一莖序列(stem)，其中環(huán)序列是與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列，而莖序列是與靶 位點(diǎn)無關(guān)的互補(bǔ)序列；在探針的兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，當(dāng) 探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相鄰，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使 得熒光基團(tuán)被猝滅，不能產(chǎn)生熒光信號，而當(dāng)探針與靶位點(diǎn)結(jié)合時，發(fā)夾結(jié)構(gòu) 被打開，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，產(chǎn)生熒光信號，通過熒光顯微鏡可以檢測 到該熒光信號。

本發(fā)明通過對大量利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌和非耐藥結(jié)核菌株的基因序列 進(jìn)行比對，挑選利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌最常見的ropB突變基因作為檢測靶點(diǎn)， 并針對該靶位點(diǎn)設(shè)計、合成三條分子信標(biāo)探針(BeaconROPB1,BeaconROPB2 和BeaconROPB3)。