[發明專利]一種快速檢測利福平耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針和試劑盒

在審

• 申請號: 201610177383.9
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105695599A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 方國偉;洪冉
• 申請（專利權）人: 蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種快速檢測利福平耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針，其特征在于， 所述分子信標探針包括BeaconROPB1、BeaconROPB2和BeaconROPB3，所 述BeaconROPB1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，所述BeaconROPB2的堿 基序列如SEQIDNO.2所示，所述BeaconROPB3的堿基序列如SEQIDNO.3 所示。

2.根據權利要求1所述的分子信標探針，其特征在于，所述BeaconROPB 1、BeaconROPB2和BeaconROPB3的5’端用相同的熒光基團標記，所述Beacon ROPB1、BeaconROPB2和BeaconROPB3的3’端用相同的熒光淬滅基團標記。

3.根據權利要求2所述的分子信標探針，其特征在于，所述熒光基團為 FITC、FAM和Cy3中的一種，所述熒光淬滅基團為DABCYL、BDH、BHQ1 和TANRA中的一種。

4.根據權利要求3所述的分子信標探針，其特征在于，所述熒光基團為Cy3， 所述熒光淬滅基團為BHQ1。

5.一種快速檢測利福平耐藥結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包括重懸液，雜交液，洗滌液和如權利要求1-4任一所述的分子信標探針。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述分子信標探針中Beacon ROPB1、BeaconROPB2和BeaconROPB3的使用濃度均為10nM。

7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述重懸液包括：0.1-0.5M 乙酸銨和5～50mMTris-HCl，pH值為4～7；

所述雜交液包括：5～20％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mM焦磷酸鈉， 0.01％～0.5％聚蔗糖，0.01％～0.5％聚乙烯吡咯烷酮，0.01％～0.5％聚乙二醇， 10～40％(v/v)去離子甲酰胺，5mMNa₂EDTA，0.01～1％(v/v)TritonX-100和 5～200mMpH7.5的Tris-HCl；

所述洗滌液包括：5～50mMTris，10～100mMNaCl，0.01～0.2％(v/v)Triton X-100和0.01～0.2％(v/v)SDS，pH值為6～10。

8.一種快速檢測利福平耐藥結核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述方法 是采用如權利要求1-4任一所述的分子信標探針進行檢測的。

9.一種快速檢測利福平耐藥結核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述方法 是采用如權利要求5-7任一所述的試劑盒進行檢測的。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)吸取1mL待測樣本，12000rpm離心1分鐘，棄上清，50μL重懸液重 懸沉淀；

(2)吸取10μL重懸后的樣本滴在載玻片上，50℃以上溫度烘干，使樣本 中細菌固定在載玻片上；

(3)將載玻片浸入無水乙醇中，浸泡5分鐘；

(4)在樣本上加入20μL雜交液，以及BeaconROPB1、BeaconROPB2和 BeaconROPB3，所述BeaconROPB1、BeaconROPB2和BeaconROPB3的終 濃度均為10nM，置于雜交儀上42～58℃雜交10分鐘；

(5)在42～58℃下用洗滌液洗滌樣本1分鐘；

(6)將樣本烤干后滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10×物鏡掃視和 計數，用40×或100×物鏡觀察細菌形態。