[發明專利]一種快速檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針和試劑盒

在審

• 申請號: 201610176424.2
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734135A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 方國偉;洪冉
• 申請（專利權）人: 蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及一種分子信標探針，具體涉及一種快速檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針和試劑盒。

背景技術

根據中國衛生部組織的第四次全國結核病流行病抽樣調查(2000年)得出的結果，我國有4億人感染過結核菌，現有的傳染性結核病人達200萬人，結核病的人數位居世界第二，僅次于印度。耐藥結核病的發生和流行是當今及今后一段時間內結核病防治工作的難題和最大挑戰。隨著分子生物學技術的發展和結核菌對抗結核藥物(特別是異煙肼和利福平)耐藥機制在基因水平的逐漸闡明，建立分子生物學的檢測耐藥方法可提高檢測的速度。盡快初篩耐藥結核病人和制定最佳治療方案，防止耐藥菌株在人群中的擴散，降低原發性耐藥，是臨床上迫切需要解決的問題。

異煙肼是主要的抗結核一線藥物,結核桿菌對異煙肼耐藥機理比較復雜,涉及多個基因,包括KatG、inhA、KasA、OxyR、aphC等,研究表明，KatG、inhA、KasA三個基因突變造成的耐藥占異煙肼耐藥結核分枝桿菌的90％以上。

前臨床上檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌常用的方法有細菌培養法和PCR法。其中細菌培養法是檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的金標準，但該方法需要進行藥敏實驗，通常需要15-20天才能看到最終的檢測結果，檢測成本高、檢測周期長；利用PCR方法可在短時間內使特定的核酸序列拷貝數幾何級數增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率高，另一方面，樣本中有往往含有抑制PCR反應的成分，這又會導致假陰性的出現，這兩方面的缺點限制了PCR檢測的臨床應用。由此可見，異煙肼耐藥結核分枝桿菌感染的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。

分子信標探針(Molecularbeaconprobe)，具有靈敏度高、特異性強、只有和靶序列雜交上了才會發出熒光等優點，被應用于熒光原位雜交。本發明通過對大量異煙肼耐藥結核分枝桿菌和非耐藥菌株的基因序列進行比對，挑選異煙肼耐藥結核分枝桿菌特有的基因KatG、inhA和KasA作為檢測靶點，并針對該靶位點設計、合成三條分子信標探針(BeaconINH1,BeaconINH2和BeaconINH3)，通過這三條探針的聯合作用，提高檢測的熒光信號強度，達到檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的效果。本發明還建立了穩定的分子信標原位雜交檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的反應體系，克服了異煙肼耐藥結核分枝桿菌當前臨床檢測的諸多問題，為異煙肼耐藥結核分枝桿菌感染的診斷、預防和控制提供新的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種快速檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針、試劑盒和方法。

為實現上述目的，所采取的技術方案：一種快速檢測異煙肼耐藥結核分枝桿菌的分子信標探針，所述分子信標探針包括BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3，所述BeaconINH1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，所述BeaconINH2的堿基序列如SEQIDNO.2所示，所述BeaconINH3的堿基序列如SEQIDNO.3所示。

本發明的技術要點或原理：熒光原位雜交(FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一種應用標記有熒光物質的探針，通過雜交的方法來檢測細胞或組織內特異性DNA或RNA的方法；分子信標探針是一種具有獨特“發夾”空間結構的探針，在未與靶序列結合時，分子信標呈“發夾”結構，有一環序列(loop)和一莖序列(stem)，其中環序列是與靶位點互補的堿基序列，而莖序列是與靶位點無關的互補序列；在探針的兩端分別標記有熒光基團和熒光猝滅基團，當探針處于發卡結構時，熒光基團和猝滅基團相鄰，產生能量共振轉移效應，使得熒光基團被猝滅，不能產生熒光信號，而當探針與靶位點結合時，發夾結構被打開，熒光基團和猝滅基團分開，產生熒光信號，通過熒光顯微鏡可以檢測到該熒光信號。

本發明通過對大量異煙肼耐藥結核分枝桿菌和非耐藥結核菌株的基因序列進行比對，挑選異煙肼耐藥結核分枝桿菌特有的基因KatG、inhA和KasA作為檢測靶點，并針對該靶位點設計、合成三條分子信標探針(BeaconINH1,BeaconINH2和BeaconINH3)。

優選地，所述BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的5’端用相同的熒光基團標記，所述BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的3’端用相同的熒光淬滅基團標記。