[發(fā)明專利]一種快速檢測異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標探針和試劑盒

在審

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• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734135A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 方國偉;洪冉
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州達麥迪生物醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種快速檢測異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針包括BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3，所述BeaconINH1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，所述BeaconINH2的堿基序列如SEQIDNO.2所示，所述BeaconINH3的堿基序列如SEQIDNO.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子信標探針，其特征在于，所述BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的5’端用相同的熒光基團標記，所述BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的3’端用相同的熒光淬滅基團標記。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子信標探針，其特征在于，所述熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述熒光淬滅基團為DABCYL、BDH、BHQ1和TANRA中的一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子信標探針，其特征在于，所述熒光基團為Cy3，所述熒光淬滅基團為BHQ1。

5.一種快速檢測異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括重懸液，雜交液，洗滌液和如權(quán)利要求1-4任一所述的分子信標探針。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述分子信標探針中BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的使用濃度均為10nM。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述重懸液包括：0.1-0.5M乙酸銨和5～50mMTris-HCl，pH值為4～7；

所述雜交液包括：5～20％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mM焦磷酸鈉，0.01％～0.5％聚蔗糖，0.01％～0.5％聚乙烯吡咯烷酮，0.01％～0.5％聚乙二醇，10～40％(v/v)去離子甲酰胺，5mMNa₂EDTA，0.01～1％(v/v)TritonX-100和5～200mMpH7.5的Tris-HCl；

所述洗滌液包括：5～50mMTris，10～100mMNaCl，0.01～0.2％(v/v)TritonX-100和0.01～0.2％(v/v)SDS，pH值為6～10。

8.一種快速檢測異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述方法是采用如權(quán)利要求1-4任一所述的分子信標探針進行檢測的。

9.一種快速檢測異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述方法是采用如權(quán)利要求5-7任一所述的試劑盒進行檢測的。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)吸取1mL待測樣本，12000rpm離心1分鐘，棄上清，50μL重懸液重懸沉淀；

(2)吸取10μL重懸后的樣本滴在載玻片上，50℃以上溫度烘干，使樣本中細菌固定在載玻片上；

(3)將載玻片浸入無水乙醇中，浸泡5分鐘；

(4)在樣本上加入20μL雜交液，以及BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3，所述BeaconINH1、BeaconINH2和BeaconINH3的終濃度均為10nM，置于雜交儀上42～58℃雜交10分鐘；

(5)在42～58℃下用洗滌液洗滌樣本1分鐘；

(6)將樣本烤干后滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10×物鏡掃視和計數(shù)，用40×或100×物鏡觀察細菌形態(tài)。