[發明專利]基于表達HBsAg和HBcAg的熱失活全重組漢遜酵母細胞的乙肝治療疫苗

有效

• 申請號: 201610176389.4
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105727279B
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 汪和睦;楊珺;王昌華
• 申請（專利權）人: 汪和睦
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;A61K39/39;A61P31/20;C12N1/19;C12R1/78
• 代理公司: 天津翰林知識產權代理事務所(普通合伙) 12210
• 代理人: 陳松

1.基于表達HBsAg和HBcAg的全重組漢遜酵母細胞的乙肝治療疫苗，所述乙肝治療疫苗包括HBsAg和HBcAg，其特征在于：所述重組漢遜酵母表達的HBcAg的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，所述重組漢遜酵母表達HBcAg的DNA序列為SEQ ID NO：3所示，含有15-21個HBcAg特異性CTL表位；所述重組漢遜酵母表達的HBsAg為adw亞型，所述重組漢遜酵母表達HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，重組漢遜酵母表達的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重組漢遜酵母細胞內HBsAg表達量為每10⁸細胞中含有6-10μg HBsAg，所述HBsAg共含有16-21個HBsAg特異性CTL表位；將熱失活的所述全重組漢遜酵母細胞作為佐劑，所述重組漢遜酵母表達HBsAg的工程菌株為HS604-5，所述的重組漢遜酵母表達HBcAg的工程菌株為HBC-40-25，所述重組漢遜酵母表達HBsAg的工程菌株構建方法包括：

1)將構建的基于SEQ ID NO：1所示序列的質粒，電轉化宿主細胞URA3-營養缺陷型漢遜酵母細胞株HU-11(CGMCC No.1218)，在MD選擇培養系平皿上挑取生長的單菌落轉化子；

2)挑選菌體生長速度快的菌落，應用半定量PCR技術檢測HBsAg基因條帶亮度后，挑選拷貝數多的菌落，連續傳代培養篩選20～400個世代；

3)經過步驟2)傳代培養篩選多拷貝異源整合轉化克隆株，采用甲醇誘導培養72小時后，放免分析測定轉化株細胞破碎后釋放出HBsAg的表達水平；

4)將經過步驟3)篩選去除游離質粒的高拷貝、高表達克隆株，采用定量PCR檢測HBsAg基因拷貝數；

5)在步驟4)的檢測結果基礎上，選擇30升發酵遺傳穩定的重組漢遜酵母HBsAg菌株作為工程菌的原代菌株HS604-5；

所述重組漢遜酵母表達HBcAg的工程菌株HBC-40-25構建方法與重組漢遜酵母表達HBsAg的工程菌株HS604-5構建方法相同，構建工程菌株HBC-40-25采用的質粒為構建的基于SEQ ID NO：3所示序列的質粒。

2.如權利要求1所述的乙肝治療疫苗，其特征在于所述重組漢遜酵母表達的HBsAg為病毒樣顆粒結構，由HBsAg插入漢遜酵母類脂組成，所述HBsAg的14個半胱酸中有9～12個形成二硫鍵，所述重組漢遜酵母表達的HBcAg為病毒樣顆粒結構。

3.根據權利要求1所述乙肝治療疫苗，其特征在于所述重組漢遜酵母表達的HBsAg共含有如下19個CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。

4.根據權利要求1所述乙肝治療疫苗，其特征在于所述重組漢遜酵母表達的HBcAg共含有如下19個CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIR DLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。

5.根據權利要求1所述乙肝治療疫苗，其特征在于所述重組漢遜酵母的宿主多形漢遜酵母細胞株為HU-11，保藏編號為CGMCC No.1218，所述宿主多形漢遜酵母的乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被破壞的DNA序列如SEQ ID NO：5所示。

6.根據權利要求1所述的乙肝治療疫苗，其特征在于所述乙肝治療疫苗的劑型為注射液劑或凍干粉針劑。