[發明專利]一種山羊BLG基因定點敲除修飾系統及應用

在審

• 申請號: 201610176047.2
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734032A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 成勇;宋紹征;朱孟敏
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/63;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，主要涉及一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及對應打靶載體的構建、應用，本發明是利用一對轉錄激活效應因子核酸酶定點敲除山羊BLG基因和敲入人乳鐵蛋白(hLF)基因，獲得BLG^-/hLF⁺轉基因胎兒成纖維細胞，并應用該細胞作為供核細胞，通過體細胞核移植制備BLG^-/hLF⁺基因打靶轉基因山羊。

背景技術

BLG是奶山羊乳乳清中的乳清蛋白成份之一，不存在于人乳中。山羊BLG基因編碼105個氨基酸。BLG分子一般在羊乳中以二聚體的形式存在，一個分子的Asp130和Glu134與另一個分子的賴氨酸殘基以共價鍵相結合。BLG是一種結構化蛋白，耐酸和耐蛋白酶水解，胃蛋白酶不能將其水解。因此，消化后人體內還存在著完整的BLG可能會引起過敏反應。2000年Hattori等的報告指出牛乳過敏癥患者中82％的人對β-乳球蛋白是敏感的。2005年Fritsche等的研究表明：BLG的抗體血清識別BLG的肽段，其中149-162肽鏈是主要的IgE識別表位。通過傳統的乳品加工方法，如酶消化、加熱和糖基化處理均難消除BLG致敏原。

人乳鐵蛋白(humanLactoferrin，hLF)是人初乳中一種功能性蛋白，具有增強免疫功能，分子量大小為80kDa。

乳鐵蛋白是一種乳蛋白，在人初乳中含量豐富，但在羊奶中含量極低，乳鐵蛋白具有廣泛而獨特的生物學功能和理化特性(抑菌、抗病毒、調節免疫、促進鐵吸收等)，國際上各個領域的學者對其進行研究。在國外，已有乳鐵蛋白的成品問世，但多為動物來源的乳鐵蛋白，而且乳鐵蛋白的天然來源有限，大規模的工業生產人乳鐵蛋白將依賴于基因工程。因此如何高效、廉價地工業化生產人乳鐵蛋白有很高的經濟價值和應用意義。目前，乳鐵蛋白研究、應用和開發僅局限于少數發達國家，成本較昂貴、表達較低及不穩定性，因此，應用基因工程技術，對其進行精細修飾，利用乳腺生物反應器以獲得高效表達重組乳鐵蛋白的轉基因生物，以滿足市場需求，這是當前研究的熱點。

近年來研究表明，hLF基因也可以在動物乳腺中表達，人乳鐵蛋白的生物活性及對人體有益的功能要大大強于動物乳鐵蛋白，因此，要動物乳中增加人乳鐵蛋白成份可顯著提高乳品質，甚至可以替代人乳。

通過對山羊BLG基因的敲除修飾，并在BLG基因座定點整合hLF基因等遺傳定向修飾，獲得乳腺特異性表達轉基因羊，可用于羊乳的人乳化改造，并且可以降低或消除乳汁中BLG過敏源，同時增加人乳鐵蛋白(HumanLactoferrin，hLF)功能成分，提高羊奶的品質，生產高端羊奶，具有很大的經濟價值和社會效應。

迄今為止，在動物轉基因研究中外源基因整合宿主動物染色體有兩種方式，一種是隨機整合，另一種是基因定點修飾。前者技術要求低，但對品種培育存在較大缺陷，外源基因在傳代過程中易丟失，易造成宿主動物其他功能異常；后者雖技術要求高，但遺傳背景清晰，外源基因傳代穩定。

哺乳動物基因定點修飾根據同源重組原理實現的，這一技術的經典方法的缺點是中靶率低，，通常只有10^-6-10^-8，對打靶載體要求高。人們一直在尋找簡單高效的基因打靶方法。近年來核酸酶指導的基因組靶向修飾技術發展迅速。這類核酸酶通常由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成，由DNA識別結構域特異的識別靶位點，把核酸酶定位到需要進行編輯的基因組區域，然后由非特異性核酸內切酶切斷DNA雙鏈，引起DNA斷裂自我修復機制，從而引發基因序列的突變和促進同源重組的發生。

人工鋅指核酸酶(ZincFingerNucleases，ZFN)技術是第一代核酸酶定點修飾技術。ZFN技術曾被作為誘導基因組突變及提高同源重組效率的主要手段。但是，由于ZFN受上下游依賴效應的影響，與靶點DNA序列之間結合不穩定，不能定位所有靶序列，需要大量的篩選和鑒定工作，易產生脫靶性突變。此外，成套的商業化的ZFN價格昂貴，設計煩鎖，效果不穩定。