[發明專利]一種山羊BLG基因定點敲除修飾系統及應用

在審

• 申請號: 201610176047.2
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734032A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 成勇;宋紹征;朱孟敏
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/63;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種山羊BLG基因定點敲除修飾系統，其特征在于所述定點敲除修飾系統為剪切山羊BLG基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs；

所述山羊BLG基因靶序列位于山羊BLG第3外顯子(NCBI,emb|Z33881.1|,8088bp)，轉錄起始位點下游，其中，3959-3974位核苷酸為左臂識別模塊，3992-4008位核苷酸為右臂識別模塊，3975-3991位核苷酸為間隔序列spacer；

所述的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由剪切識別模塊TALEN-3-L和剪切別模塊TALEN-3-R組成，所述剪切識別模塊TALEN-3-L的序列如SEQIDNO.1所示，所述剪切別模塊TALEN-3-R的序列如SEQIDNO.2所示。

2.一種山羊BLG基因定點整合系統，所述定點整合系統為人乳鐵蛋白打靶載體BLTF-7-82；所述的BLTF-7-82打靶載體由山羊BLG同源臂DNA序列、功能基因hLF及負篩選基因TK組成。

3.一種述山羊BLG基因定向修飾系統的制備方法，其特征在于：

在山羊BLG基因座位點一步法敲除BLG基因部分序列導致BLG表達失活的同時在同一位點整合hLF基因；包括在山羊BLG序列特定位點設計TALENs識別序列和刪除序列，并以BLG序列為同源臂，連接功能基因hLF和篩選基因，組成基因打靶載體BLC14-TK的目步驟。

4.一種含有權利要求1所述山羊BLG基因定點敲除系統的重組表達載體、重組菌。

5.權利要求1所述山羊BLG基因定點敲除系統在制備BLG^-/hLF⁺轉基因胎兒成纖維細胞中的應用。

6.權利要求1所述山羊BLG基因定點敲除系統在制備BLG^-/hLF⁺基因打靶轉基因山羊中的應用。

7.一種BLG^-/hLF⁺基因打靶轉基因山羊的制備方法，其特征在于：利用權利要求1所述山羊BLG基因定點敲除修飾系統定點敲除山羊BLG基因和敲入人乳鐵蛋白(hLF)基因，獲得BLG^-/hLF⁺轉基因胎兒成纖維細胞，并應用該細胞作為供核細胞，通過體細胞核移植制備BLG^-/hLF⁺基因打靶轉基因山羊。