[發明專利]水蜜桃果實ICE1基因、其克隆方法及應用

在審

• 申請號: 201610175621.2
• 申請日: 2016-03-26
• 公開（公告）號: CN105695481A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 萬嗣寶;朱月瑩
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 顧勇華

技術領域

本發明涉及涉及一種水蜜桃果實ICE1基因、其克隆方法及應用。

背景技術

ICE1（inducerofCBFexpression1）是植物低溫響應基因中最上游的一個轉錄 因子。它在低溫時特定地結合到CBF3基因的啟動子序列上，誘導CBF3的表達，而后CBF3結合 到其下游目的基因啟動子的DRE序列上，誘導下游一系列冷誘導基因COR以及在植物寒冷適 應中起作用的其他基因的表達，從而提高植株的抗寒性。水蜜桃屬于典型的呼吸躍變型水 果，不易保鮮，在低溫運輸、貯藏過程中易發生冷害。冷害不僅影響果實的商品價值，而且會 加劇升溫后的腐爛、品質劣變，進而影響果實的貨架期。目前，還未見水蜜桃ICE1基因功能 的報道。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種水蜜桃ICE1基因。

本發明的目的之二在于提供該基因的克隆方法。

本發明的目的之三在于提供該基因在農桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥中的 應用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案如下：

一種水蜜桃果實ICE1基因，其特征在于該基因為SEQIDNO.1所示的堿基序列。

一種上述的水蜜桃果實ICE1基因的編碼蛋白，其特征在于該編碼蛋白為SEQID NO.1所示的堿基序列的氨基酸序列。

一種載體，其特征在于該載體含有上述的水蜜桃果實ICE1基因。

一種重組質粒，其特征在于該質粒含有上述的載體。

一種上述的水蜜桃果實ICE1基因的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.以蘋果ICE1，即ABS50251為探針，在NCBI中對桃基因組數據庫進行BLAST搜索，檢索 出一條具有完整開放閱讀框的核甘酸序列XM_007209914，即為預測的桃ICE1基因序列；

b.提取水蜜桃果實總RNA，然后反轉錄獲取cDNA第一鏈;根據預測的桃ICE1序列XM_ 007209914設計擴增ICE1基因的上游引物S1和下游引物S2；再以所述反轉錄獲得的cDNA為 模板，進行聚合酶鏈式PCR反應，即得到水蜜桃果實ICE1基因；

所述的上游引物S1為：5’-TGGGCTCTCTGTCTACCT-3’；

所述的下游引物S2：5’-ACGACTCCCGTCTTTGGT-3’。

上述的PCR反應的反應體系為：2×高保真PCRMix15μL，模板1μL，上下游引物各1μ L，加ddH₂O至30μL；所述的PCR反應的反應條件為：94℃預變性4min；94℃變性30s，47℃退火 30s，68℃延伸3min，35個循環；68℃再延伸10min。

一種根據上述的水蜜桃果實ICE1基因在農桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥中 的應用。

以反轉錄獲取的cDNA為模板，用即用型高保真PCR試劑盒進行擴增反應，產物與 PGM-T載體構建重組質粒，轉化TOP10感受態細胞并進行測序。測序結果與預測的桃ICE1序 列（XM_007209914）一致性為99.72％。對測序序列所編碼的氨基酸序列進行結構域分析，發 現其擁有一個bHLH區域（含44個氨基酸殘基），這個區域的氨基酸序列同蘋果ICE1的bHLH結 構域高度保守。可見，該測序序列即為水蜜桃果實ICE1基因序列，該序列已提交BanKit（登 錄號為KT148884）。

根據水蜜桃果實ICE1基因序列設計擴增其開放閱讀框序列的上、下游引物（分別 引入酶切位點KpnⅠ和BamHⅠ序列）。ICE1基因開放閱讀框，基因序列為：SEQIDNO.5。擴增構 建正義表達載體的ICE1序列引物為：上游引物ICE1-KpnⅠ：SEQIDNO.6；下游引物ICE1- BamHⅠ：SEQIDNO.7。擴增構建反義表達載體的ICE1序列引物為：上游引物ICE1-BamHⅠ：SEQ IDNO.8；下游引物ICE1-KpnⅠ：SEQIDNO.9。

以測序菌樣為模板，用即用型高保真PCR試劑盒擴增水蜜桃果實ICE1基因的開放 閱讀框序列。產物與PGM-T載體構建重組質粒，轉化TOP10感受態細胞，再次進行序列測序。 測序結果與首次測序結果同源性為100％。

1.正義、反義植物表達載體PCAMBIAy1300-ICE1的構建