[發明專利]一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法

在審

• 申請號: 201610173177.0
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105755127A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 楊世華;張文輝;鄧英華;吳綺琪;黃群山
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法。

背景技術

至今未發現與本發明相同或類似的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術中存在的缺點與不足，提供一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法。所述的方法對基因敲除的囊胚進行敲除鑒定，避免了非敲除胚胎的移植，提取囊胚單細胞不會對囊胚造成大的傷害，且能提前準確的得出敲除結果，該鑒定方法既縮短了實驗時間，又節約了實驗經費。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法，具體的步驟如下：

(1)提取囊胚單個細胞：利用piezo顯微操作針沖擊透明帶，取單細胞；這種單細胞提取方式極大地減少了細胞的損傷，提高動物克隆操作的成功率；

(2)基因組DNA提取：用SIGMA的GenemePlexSingleCellWholeGenomeAmplificationKit試劑盒提取基因組DNA；

(3)NestedPCR擴增目的基因片段：設計兩對引物擴增目的基因，利用TaKaRaEx進行PCR反應；

(4)參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說明書回收得到目的DNA片段；

(5)連接載體：利用TAKARA的DNALigationKitVer.2.1將目的基因連接到骨架載體上，轉化DH5α后涂布到鋪有LB固體培養基的培養皿中37℃培養12h，次日挑單克隆菌落加到LB液體培養基中搖菌過夜；

(6)測序：收集菌液利用TINGENTIANprepMiniPlasmidKit試劑盒提取質粒，測序驗證敲除效果。

步驟(2)中基因組DNA提取的具體步驟為：在盛有步驟(1)獲取的單細胞的PCR管中加入ProteinaseKSolution0.1ul，加10×SingleCellLysis&FragmentationBuffer1.6ul，用無菌雙蒸水補足10ul；瞬時離心后，將PCR管放入PCR儀進行反應：50℃60min；99℃4min，獲得基因組DNA。

步驟(3)中所述的目的基因為食蟹猴SHANK3基因時，兩對引物中的外引物F為GACCCCTGTTTGTGGATGTACAGG，外引物R為CCGTGGCCCGGGGTCTGCTGGGGTGCCGC，產物大小為385bp；

兩對引物中的內引物F為GGTCCCTGGCTTCCCCGGCCTTCTCC，內引物R為GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGC，產物大小為298bp。

步驟(4)中參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說明書回收得到目的DNA片段的具體步驟如下：加兩倍PCR產物體積的BufferPB，混勻后過柱離心，棄廢液，向柱子中加200ul的BufferPE，離心棄廢液，空柱離心2min；加入10ulBufferEB離心洗脫，獲得目的DNA片段。

驗證靈長類動物囊胚團敲除效果時，不僅可通過提取單細胞驗證，也可以通過提取多個細胞進行驗證；基因組DNA的提取、目的基因的擴增和純化回收可采用其它的試劑盒，如ZYMORESEARCH的DNAClean&Concentrator^TM-5試劑盒進行純化回收。回收得到的目的基因可直接送生工進行連接轉化，挑單克隆和測序。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

1.本發明所述的方法可用于鑒定非人靈長類動物囊胚基因敲除的效果，鑒定后移植給代孕動物，提高了基因敲除動物的生產效率；

2.本發明減少了實驗中非人靈長類受精卵的使用數量，有效減少了實驗經費的開支；

3.本發明利用piezo顯微操作針細微沖擊透明帶獲取單細胞，這種單細胞提取方式極大地減少了細胞的損傷，提高動物克隆操作的成功率。

4.本發明為其他瀕危珍稀靈長類動物轉基因技術的研究提供經驗借鑒。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

1)選取一個食蟹猴囊胚團，提取單細胞：利用piezo顯微操作針沖擊透明帶，獲取單細胞，這種單細胞提取方式極大地減少了細胞的損傷，提高動物克隆操作的成功率；