[發(fā)明專利]一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物囊胚基因敲除的鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610173177.0
• 申請(qǐng)日: 2016-03-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105755127A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊世華;張文輝;鄧英華;吳綺琪;黃群山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達(dá)律師事務(wù)所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：具體的步驟如下：

(1)提取囊胚單個(gè)細(xì)胞：利用piezo顯微操作針沖擊透明帶，取單細(xì)胞；這種單細(xì)胞提取方式極大地減少了細(xì)胞的損傷，提高動(dòng)物克隆操作的成功率；

(2)基因組DNA提取：用SIGMA的GenemePlexSingleCellWholeGenomeAmplificationKit試劑盒提取基因組DNA；

(3)NestedPCR擴(kuò)增目的基因片段：設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增目的基因，利用TaKaRaEx進(jìn)行PCR反應(yīng)；

(4)參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說(shuō)明書(shū)回收得到目的DNA片段；

(5)連接載體：利用TAKARA的DNALigationKitVer.2.1將SHANK3基因連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α后涂布到鋪有LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)12h，次日挑單克隆菌落加到LB液體培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜；

(6)測(cè)序：收集菌液利用TINGENTIANprepMiniPlasmidKit試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證敲除效果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(2)中囊胚基因組DNA提取的具體步驟為：在盛有步驟(1)獲取的單細(xì)胞的PCR管中加入ProteinaseKSolution0.1ul，加10×SingleCellLysis&FragmentationBuffer1.6ul，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足10ul；瞬時(shí)離心后，將PCR管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)：50℃60min；99℃4min，獲得基因組DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(3)中所述的目的基因?yàn)槭承泛颯HANK3基因時(shí)，兩對(duì)引物中的外引物F為GACCCCTGTTTGTGGATGTACAGG，外引物R為CCGTGGCCCGGGGTCTGCTGGGGTGCCGC，產(chǎn)物大小為385bp；

兩對(duì)引物中的內(nèi)引物F為GGTCCCTGGCTTCCCCGGCCTTCTCC，內(nèi)引物R為GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGC，產(chǎn)物大小為298bp。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(4)中參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說(shuō)明書(shū)回收得到目的DNA片段的具體步驟如下：加兩倍PCR產(chǎn)物體積的BufferPB，混勻后過(guò)柱離心，棄廢液，向柱子中加200ul的BufferPE，離心棄廢液，空柱離心2min；加入10ulBufferEB離心洗脫，獲得目的DNA片段。