[發明專利]一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法

在審

• 申請號: 201610173177.0
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105755127A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 楊世華;張文輝;鄧英華;吳綺琪;黃群山
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：具體的步驟如下：

(1)提取囊胚單個細胞：利用piezo顯微操作針沖擊透明帶，取單細胞；這種單細胞提取方式極大地減少了細胞的損傷，提高動物克隆操作的成功率；

(2)基因組DNA提取：用SIGMA的GenemePlexSingleCellWholeGenomeAmplificationKit試劑盒提取基因組DNA；

(3)NestedPCR擴增目的基因片段：設計兩對引物擴增目的基因，利用TaKaRaEx進行PCR反應；

(4)參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說明書回收得到目的DNA片段；

(5)連接載體：利用TAKARA的DNALigationKitVer.2.1將SHANK3基因連接到PMD18-T載體上，轉化DH5α后涂布到鋪有LB固體培養基的培養皿中37℃培養12h，次日挑單克隆菌落加到LB液體培養基中搖菌過夜；

(6)測序：收集菌液利用TINGENTIANprepMiniPlasmidKit試劑盒提取質粒，測序驗證敲除效果。

2.根據權利要求1所述的非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(2)中囊胚基因組DNA提取的具體步驟為：在盛有步驟(1)獲取的單細胞的PCR管中加入ProteinaseKSolution0.1ul，加10×SingleCellLysis&FragmentationBuffer1.6ul，用無菌雙蒸水補足10ul；瞬時離心后，將PCR管放入PCR儀進行反應：50℃60min；99℃4min，獲得基因組DNA。

3.根據權利要求1所述的非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(3)中所述的目的基因為食蟹猴SHANK3基因時，兩對引物中的外引物F為GACCCCTGTTTGTGGATGTACAGG，外引物R為CCGTGGCCCGGGGTCTGCTGGGGTGCCGC，產物大小為385bp；

兩對引物中的內引物F為GGTCCCTGGCTTCCCCGGCCTTCTCC，內引物R為GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGC，產物大小為298bp。

4.根據權利要求1所述的非人靈長類動物囊胚基因敲除的鑒定方法，其特征在于：步驟(4)中參照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit說明書回收得到目的DNA片段的具體步驟如下：加兩倍PCR產物體積的BufferPB，混勻后過柱離心，棄廢液，向柱子中加200ul的BufferPE，離心棄廢液，空柱離心2min；加入10ulBufferEB離心洗脫，獲得目的DNA片段。