[發明專利]一種與牙鲆數量性狀相關的SNP標記、其篩選方法及應用

有效

• 申請號: 201610172234.3
• 申請日: 2016-03-24
• 公開（公告）號: CN105713974B
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 張曉彥;王桂興;侯吉倫;王玉芬;劉海金;于清海;楊立更
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院北戴河中心實驗站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 王金寶

1.一種與牙鲆數量性狀相關的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記包括：SNP1標記、SNP2標記和SNP3標記，所述SNP標記位于MSTN基因上，所述MSTN基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

所述SNP1標記位于MSTN基因第2個內含子第741bp位置，其堿基為C或T；

所述SNP2標記位于MSTN基因第3個外顯子第30bp位置，其堿基為C或T；

所述SNP3標記位于MSTN基因3’UTR第330bp位置，其堿基為C或A。

2.一種權利要求1中MSTN基因的擴增方法，其特征在于，使用第一引物組和第二引物組從所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNP1標記和SNP2標記位于所述MSTN2片段上，所述SNP3標記位于所述MSTN3片段上；所述第一引物組包括第一上游引物和第一下游引物，所述第二引物組包括第二上游引物和第一下游引物；第一上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，第二上游引物的序列如SEQID NO：4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根據權利要求2所述的MSTN基因的擴增方法，其特征在于，使用第一引物組和第二引物組從所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段之前，先對所述MSTN基因進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，使用的反應體系為：總體積為50μL，DNA 1μL，10*buffer 5μL，Mg²⁺5μL，dNTP 1μL，引物1μL/條，Taq酶0.6μL，余量為水。

4.根據權利要求3所述的MSTN基因的擴增方法，其特征在于，在PCR擴增過程中，使用的PCR擴增程序為：在94℃溫度下預變性3min；然后進行35個循環，其中每個循環依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性15s，在55℃溫度下復性15s，在72℃溫度下延伸30s；完成35個循環之后，在72℃的溫度下延伸3min。

5.權利要求1所述的SNP標記在牙鲆篩選中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

牙鲆篩選：根據GB/18654.3-2008中的數量性狀指標為標準，篩選得到不同的牙鲆，數量性狀指標包括但不限于全長、體長和體高；

同池混養：將篩選后的牙鲆在同池中混養；

基因分型：一定的養殖周期后，對不同牙鲆的MSTN基因中所述SNP標記進行鑒定，同時根據GB/18654.3-2008標準，測得不同牙鲆的數量性狀指標；

對不同牙鲆的數量性狀指標與其SNP標記的基因型進行關聯分析。

7.權利要求6所述的應用，其特征在于，在篩選出牙鲆之后，將每條牙鲆分別經過誘導得到不同的雌核發育家系和/或雜合克隆家系，并對每個雌核發育家系和/或雜合克隆家系進行熒光標記；標記完成后，將所有家系中的牙鲆同池混養。

8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述基因分型步驟中，對每條牙鲆的MSTN基因進行PCR擴增后，對PCR產物使用SNaPshot SNP分型方法對牙鲆的MSTN基因進行鑒定，SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如下：所述SNP1標記對應的第一延伸引物的序列如SEQ ID NO：6所示；所述SNP2標記對應的第二延伸引物的序列如SEQ ID NO：7所示；所述SNP3標記對應的第三延伸引物的序列如SEQ ID NO：8所示；針對每個SNP標記的延伸體系及反應相同，延伸反應體系為：總體積為6μL，PCR產物2μL，Snapshot Mix試劑1μL，延伸引物0.3μL，余量為水；延伸程序為：在96℃溫度下變性1min，然后進行30個循環，其中每個循環依次包括以下步驟：96℃溫度下變性10s，在52℃溫度下復性5s，在60℃溫度下延伸30s；延伸程序結束后，使用測序儀對延伸產物進行測序。