[發明專利]牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法

在審

• 申請號: 201610170363.9
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN107224613A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 張建國;周彥恒;施松濤
• 申請（專利權）人: 北京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/50;A61L27/58
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，尤其是涉及一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法。

背景技術

間充質干細胞分化再生軟骨是一種優良的組織工程方法，間充質干細胞是一種能接受天然微環境信號而多向分化的多能干細胞。當提供合適的生長因子，間充質干細胞在細胞球狀培養和多種生物材料中能生成軟骨和分泌軟骨特有基質。

在牙源性間充質干細胞中，牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞因其易從口腔和牙科操作廢棄的生物組織中獲取而擁有獨特優勢，且通過體內體外試驗均驗證了這些牙源性間充質干細胞的多向分化能力。

間充質干細胞有效分化為軟骨細胞需要核實的微環境和信號分子，如TFG-β1、BMP-4和FGF-2等生長因子。干細胞載體對于干細胞體內活動和再生過程也具有重要作用。

因此，通過改造干細胞外基質的理化性質來設計一種合適的微環境，以創造合適的干細胞環境，而引導干細胞分化為特定表型。

發明內容

本發明的目的在于提供一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，為實現上述方法本發明提供如下技術方案：

牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

步驟a.祖細胞提取和培養

選擇并提取第三磨牙的牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞，要求：18-25歲的健康男性成人，無牙周病史。

為評估克隆形成，在培養皿中植入0.1*10⁶個細胞并培養14天，再用甲苯胺藍染色，將超過50個細胞數的克隆作為一個陽性CFU-F。實驗組選用第四代細胞，人骨髓間充質干細胞作為陽性對照組。

步驟b.細胞流式分析

選取數量約為5*10⁵個第四代細胞，用PE或者FITC鼠單克隆抗人CD34和CD45流式抗體孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(間充質干細胞表面標志物)或lgGs作為同型對照。

步驟c.生物材料的制備

采用高濃度古羅糖醛酸的RGD-coupled藻酸鹽，對其進行處理以提高降解性，并與TGF-β1混合。

步驟d.細胞的包被

選取PDLSC和GMSC以及作為陽性對照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中以形成微球。

所述步驟c中的生物材料的制備還包括以下分步驟：

分步驟1：選取高濃度古羅糖醛酸的RGD-coupled藻酸鹽；

分步驟2：為提高上述藻酸鹽的生物降解性，將其進行純化處理，以及部分氧化(2％)處理；

分步驟3：將上述經過處理后的藻酸鹽與TGF-β1(500ug/ml)充分攪拌混合，濃縮、真空凍干。

所述步驟d中的細胞包被還包括以下分步驟：

分步驟1：將PDLSC和GMSC以及陽性對照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中；

分步驟2：采用注射器將藻酸鹽(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流體裝置，藻酸鹽被大豆油分離成液滴；

分步驟3：將上述液滴逐滴滴入裝有100mM CaCl₂溶液的petri盤中進而形成微球；

分步驟4：將上述微球置于37℃環境下孵育45分鐘從而完成交聯；

分步驟5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。

本發明所提供的方法有益效果是：利用RGD修飾的藻酸鹽所具有的獨特的三維支架結構，并添加有TFG-β1配體，包被著牙源性間充質干細胞，產生最佳的軟骨再生效果，有望應用于顳下頜關節盤的重建和四肢骨骼修復。這種材料能夠支持PDLSCs和GMSCs在體內和體外的存活、新陳代謝和成軟骨分化，有望將其運用于顳下頜關節盤的軟骨再生種子細胞。本系統包埋牙源性間充質干細胞容易操作，是一個三維可注射可生物降解的軟骨組織工程細胞運載支架。

附圖說明

圖1是本發明的步驟流程示意圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例：參照圖1所示，本發明所提供的一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法包括以下步驟：