[發明專利]牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法

在審

• 申請號: 201610170363.9
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN107224613A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 張建國;周彥恒;施松濤
• 申請（專利權）人: 北京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/50;A61L27/58
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

1.牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，其特征在于，該方法包含以下步驟：

步驟a.祖細胞提取和培養

選擇并提取第三磨牙的牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞，要求：18-25歲的健康男性成人，無牙周病史；

為評估克隆形成，在培養皿中植入0.1*10⁶個細胞并培養14天，再用甲苯胺藍染色，將超過50個細胞數的克隆作為一個陽性CFU-F。實驗組選用第四代細胞，人骨髓間充質干細胞作為陽性對照組；

步驟b.細胞流式分析

選取數量約為5*10⁵個第四代細胞，用PE或者FITC鼠單克隆抗人CD34和CD45流式抗體孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(間充質干細胞表面標志物)或lgGs作為同型對照；

步驟c.生物材料的制備

采用高濃度古羅糖醛酸的RGD-coupled藻酸鹽，對其進行處理以提高降解性，并與TGF-β1混合；

步驟d.細胞的包被

選取PDLSC和GMSC以及作為陽性對照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中以形成微球。

2.根據權利要求1所述的牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，其特征在于：所述步驟c中的生物材料的制備還包括以下分步驟：

分步驟1：選取高濃度古羅糖醛酸的RGD-coupled藻酸鹽；

分步驟2：為提高上述藻酸鹽的生物降解性，將其進行純化處理，以及部分氧化(2％)處理；

分步驟3：將上述經過處理后的藻酸鹽與TGF-β1(500ug/ml)充分攪拌混合，濃縮、真空凍干。

3.根據權利要求1所述的牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，其特征在于：所述步驟d中的細胞包被還包括以下分步驟：

分步驟1：將PDLSC和GMSC以及陽性對照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中；

分步驟2：采用注射器將藻酸鹽(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流體裝置，藻酸鹽被大豆油分離成液滴；

分步驟3：將上述液滴逐滴滴入裝有100mM CaCl₂溶液的petri盤中進而形成微球；

分步驟4：將上述微球置于37℃環境下孵育45分鐘從而完成交聯；

分步驟5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。