[發明專利]以子葉節為外植體建立葫蘆高效再生體系的方法

在審

• 申請號: 201610168309.0
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105766640A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 張曼;羊杏平;徐錦華;胡雪丹;劉廣;姚協豐;李蘋芳;任潤生
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 翁斌

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種以子葉節為外植體建立 葫蘆高效再生體系的方法。

背景技術

葫蘆(LagenariasicerariaStandl.)為葫蘆科(Cucurbitaceae)葫蘆屬，一年 生草本植物。起源于非洲。其嫩果可食用，成熟果可做容器。此外，葫蘆還具 有一項特別的用途，即可用作西瓜甜瓜的嫁接砧木。最初采用葫蘆嫁接的目的 是控制西瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)。枯萎病是西瓜生產上一種 毀滅性的土傳病害，屬于尖孢鐮刀菌西瓜專化型，在西瓜整個生育期均會發生， 病菌主要以菌絲、厚垣孢子或菌核為主要侵染源，重茬地一般發病嚴重，甚至 絕收。通過嫁接，利用葫蘆砧木高抗或免疫的特點，有效地提高了西瓜對土傳 病害的抗性，同時由于其可有效克服連作障礙、減少環境污染，加上操作方便、 適合規模育苗以及能有效提高西瓜抗逆性等綜合優勢，因此在生產中得以廣泛 應用。

國內外大量實驗證明葫蘆砧木不但能提高西甜瓜對土傳病害的抗性，還能 增強西甜瓜對其他病(疫病、白粉病、果腐病、黃萎病等)、蟲(根結線蟲) 害和病毒病的抵抗能力。同時，葫蘆砧木嫁接也提高了西甜瓜對非生物逆境如 低溫脅迫的抵抗力。

優良葫蘆砧木新品種的選育和配套的嫁接栽培技術是西甜瓜嫁接栽培成功 的關鍵。傳統的葫蘆遺傳改良主要采用常規育種方法，通過雜交選育F1代雜交 種。但是，葫蘆常規育種周期長、難度大且遺傳性狀不穩定，極大地制約了優 良葫蘆砧木品種的選育進程。相比之下，轉基因技術具有操作簡單、成本低、 育種周期短的特點，廣泛應用于作物改良。采用基因工程技術手段進行種質創 新，首先要建立高效的植株再生體系。目前在葫蘆科作物中已有黃瓜、甜瓜、 西瓜、筍瓜等報道了植物再生體系，而鮮見有關葫蘆的組織培養相關的研究報 道。再生體系的建立受到基因型、外植體類型、組織培養條件(如培養基類型、 激素水平等)等因素的影響。雖然葫蘆科其他作物已建立了再生體系，但由于 葫蘆科作物遺傳基礎狹窄，已有的再生體系不能成功應用于葫蘆，在實際操作 過程中重復性差，且再生率極低。因此，急需研發一種高效、穩定且簡便易行 的葫蘆再生體系，為進一步通過基因工程手段進行葫蘆的種質創新和遺傳改良， 進而培育優良葫蘆砧木新品種奠定基礎。

發明內容

本發明主要提供了一種以子葉節為外植體建立葫蘆高效再生體系的方法， 提供的方法不僅芽誘導率高、操作簡單、易于實施，適用于葫蘆種質創新、遺 傳改良等基因操作。其技術方案如下：

一種以子葉節為外植體建立葫蘆高效再生體系的方法，包括以下步驟：

(1)挑取成熟飽滿的種子，去殼得籽粒，將籽粒做消毒處理，再轉接到無 激素的MS基礎培養基上黑暗環境下恒溫培養至種子萌發，獲得無菌苗；

(2)取無菌苗，切去胚芽和下胚軸，分開子葉，每半片子葉橫切，獲得子 葉節外植體；

(3)將子葉節外植體接種于不定芽誘導培養基MS1中培養，期間定期更 換培養基，獲得不定芽簇；

(4)將不定芽簇從外植體上剝離，轉接至繼代培養基MS2中，繼續培養， 期間定期更換培養基，待不定芽長到3-4cm高時，分開不定芽簇，獲得單個不 定芽苗；

(5)將單個不定芽苗轉接至生根培養基MS3中，培養至生根；

(6)將生根的再生植株進行煉苗處理；

(7)煉苗完成后，取出幼苗，洗去根部培養基，移栽于育苗基質中，放于 溫室培養。

優選的，步驟(1)中對籽粒消毒處理的方法為，先用體積含量為70％的無 水乙醇對籽粒表面消毒35-45S，用無菌水沖洗2-3次，再用質量濃度為10％的 NaClO消毒8-12min，再用無菌水沖洗2-3次，最后置于無菌濾紙上控干水分。

優選的，步驟(2)中選取萌發3d的無菌苗。

優選的，步驟(3)中不定芽誘導培養基MS1包括：MS培養基、3.0mg·L^-1的6-BA、0.01mg·L^-1的2,4-D、0.3mg·L^-1的AgNO₃、30g·L^-1的蔗糖和8g·L^-1的瓊脂，不定芽誘導培養基MS1的pH為5.6-6.0。