[發(fā)明專利]一種快速無掩模的細胞二維圖形化制作方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610167948.5
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN107227297A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 劉連慶;楊文廣;于海波;王越超
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽自動化研究所
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 徐麗,周秀梅

技術領域

本發(fā)明涉及一種快速制作細胞二維圖形的技術，具體是一種基于數(shù)字微鏡陣列的快速無掩模的細胞二維圖形化制作方法。

背景技術

生物學被認為是21世紀最有前景的學科，不僅僅是因為生物學目前有大量需要亟需解決的問題和挑戰(zhàn)，更為重要的是，它與人類生活諸如人口、疾病、健康等問題息息相關。而細胞生物學是生物學重要的基礎學科之一，是在顯微、亞顯微和分子水平三個層次上，研究細胞的結構、功能和各種生命規(guī)律的一門學科。細胞在生物學中扮演著至關重要的角色，作為個體，細胞是獨立的能夠生長、增殖、凋亡，作為整體，細胞又能共同協(xié)作配合形成具有特定功能的組織和器官進而構成一個生命體。1665年英國學者胡克用自制的顯微鏡第一次開啟了細胞的世界，至此拉開了對細胞探索的序幕。

通過對細胞差別生長、細胞遷移、粘附和細胞連接等細胞行為學的研究，不僅僅可以揭示生命活動的本質和細節(jié)，而且能夠有效的解決當今重大疑難疾病治療的世界性難題。特別是治療癌癥，系統(tǒng)免疫性疾病，一些常規(guī)藥物無法達到治療效果的病例，應用細胞治療都可以得到較為理想的效果，現(xiàn)在在國內應用自身免疫細胞治療疾病也有很大的發(fā)展。由于細胞生物學所研究的主要對象是細胞，如果直接在生物體內進行研究是非常困難的，這主要是因為細胞所在身體內環(huán)境是不斷變化而且不可控的，而且使得細胞行為發(fā)生變化的原因會存在多種，無法實現(xiàn)可控的研究單一因素的影響。因此，需要我們在體外構建細胞的微環(huán)境，將對細胞行為的研究由復雜不可控的體內環(huán)境轉移到體外可控便于操作的環(huán)境中，這對于研究細胞生物學具有重要的意義。

上世紀90年代發(fā)展起來的基于微納加工的細胞圖形化技術，使得研究人員能夠精確的在二維平面控制多種細胞位置，甚至單細胞形狀，不僅為細胞生物學的基礎研究提供了強大的工具，而且使將來體外模擬組織器官的機構和功能 成為了可能。現(xiàn)有的圖形化的方法多為自上而下的加工方法，如光刻法，但是這些方法的成本高，環(huán)境要求高。另外一些方法則是自下而上的圖形化方法，主要有，軟光刻，掃描探針加工以及納米壓印等方法，這些方法中，其準備過程和操作都非常復雜，耗時較多，有的還需要進行復雜的化學修飾。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術中存在的上述不足之處，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種快速無掩模的細胞二維圖形化制作方法。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案是：一種快速無掩模的細胞二維圖形化制作方法，包括以下步驟：

將設計的二進制圖形導入到數(shù)字微鏡陣列中，并將聚乙二醇二丙烯酸甲酯PEGDA與光引發(fā)劑2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦TPO的混合溶液滴在蓋玻片表面；

數(shù)字微鏡陣列將紫外入射光投影到蓋玻片表面；

調整紫外入射光的功率，激發(fā)混合溶液發(fā)生交聯(lián)反應并固化粘附在蓋玻片表面，使固化后的水凝膠形狀與設計圖形的形狀和光斑形狀一致；

將蓋玻片經(jīng)過酒精浸泡和磷酸鹽緩沖液沖洗后，放入細胞培養(yǎng)皿中，并加入細胞培養(yǎng)基和細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)皿放入二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

所述混合溶液為使用75％的酒精配置的聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA和光引發(fā)劑TPO混合溶液，PEGDA的濃度為40％，TPO的濃度為0.5wt％。

所述混合溶液的制備方法包括以下步驟：

將PEGDA溶于酒精之中，待攪拌均勻后再加入光引發(fā)劑TPO，PEGDA的最終濃度為40％，TPO的濃度為0.5wt％。

所述將蓋玻片經(jīng)過酒精浸泡和磷酸鹽緩沖液沖洗，包括以下步驟：

將帶有固化后的PEGDA水凝膠微結構的蓋玻片放入75％的酒精中，清洗掉未反應的水凝膠；

將酒精清洗后蓋玻片放入磷酸鹽緩沖液中，進行二次清洗，除去附著在表面的酒精。

所述蓋玻片為玻璃。

所述細胞培養(yǎng)基為Hyclone RPMI-1640，加入量為7-10ml。

所述細胞懸浮液為100μl乳腺癌細胞(MCF-7)濃度為3×106細胞懸浮液。

本發(fā)明可實現(xiàn)動態(tài)化，程序化的細胞圖形化方法，并不需要任何物理模板以及表面化學修飾，并且基底為普通的玻璃，無需特殊材料。具體具有以下特點：

1.紫外光照射激發(fā)光引發(fā)產生自由基，自由基與PEGDA單體相結合，從而引發(fā)水凝膠的交聯(lián)反應。自由基只在光斑照射的地方存在。

2.通過控制光斑的形狀來控制PEGDA交聯(lián)聚合后的形狀，制作出各種水凝膠固化圖案。利用這種微圖形的制作方法，可以不需要物理模板，直接根據(jù)所需形狀設計光斑，并且可以動態(tài)化的控制水凝膠形狀的大小和位置。