[發明專利]一種人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201610166682.2
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105713871A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 閆姍姍;李一佳;甘明川;莫春紅
• 申請（專利權）人: 云南舜喜再生醫學工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種可應用于臨床級的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法。

背景技術

間充質干細胞(MSC)是一類具有自我更新能力且在適合微環境下具有多系分化潛能的原始細胞。它首先在骨髓中發現，隨后分別在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在臍帶、臍帶血、胎盤組織中分離出來。由于其具有強大的增殖能力，較強的分化能力，低免疫原性和免疫調節功能，其在臨床上的應用價值越來越受人們關注。

作為要應用于臨床細胞治療的細胞產品，應當具有組織取材方便，來源廣泛，不受倫理限制，分離過程簡單等特點。而骨髓來源的MSC取材難，細胞增殖和分化能力受供體年齡限制，異體移植存在免疫排斥強等缺點，所以尋求一種來源豐富，干細胞含量高，取材方便，無創性并且不受倫理學限制的MSCs來源已然成為如今的研究熱點。最近有研究發現，人絨毛膜間充質干細胞具有自我更新和多向分化潛能，有低免疫原性，用于同種異體、異種異體移植后，不會發生免疫排斥反應，無致瘤性，這為各種疾病的細胞替代治療提供了新的選擇。

絨毛膜來源于孕婦產后的胎盤組織，具有一定的彈性，易于從胎盤組織中剝離，因此絨毛膜被公認為是間充質干細胞來源之一。

現有技術中，制備絨毛膜間充質干細胞的方法存在的不足之處：

目前，絨毛膜間充質干細胞的分離方法有組織塊培養法和酶消化法兩種，應用較多的分離方法是酶消化法，酶消化法具有分離培養周期短等優點，但酶消化法所利用的酶種類繁多，多數利用胰酶和膠原酶分步處理的消化方法，耗時長，步驟繁瑣，消化過程中還會對細胞造成較大傷害，使細胞活力減弱，而且分離過程中使用了多種酶和血清，引入了多種外源物質，對間充質干細胞應用于臨床造成阻礙。組織塊培養法獲得的間充質干細胞具有細胞純度高，細胞活力強等優點，但分離成功率低，培養周期長，而且培養中加入胎牛血清等動物源性成分，增加了培養成本，也引入了外源動物蛋白，使培養的細胞不利于臨床應用。在絨毛膜剝離過程中不會去除附著在絨毛膜上的毛細血管，使得分離獲得的細胞種類復雜，參雜了許多內皮細胞和血細胞，影響間充質干細胞的正常生長過程。胎盤采集及絨毛膜分離的現有技術還缺少有效減少污染的措施，防污染措施作用有限，原代培養污染率高，缺少從源頭開始減少污染的方法，目前在培養環節添加抗生素只能在培養過程中抑制污染菌繁殖，不能有效減少污染；培養體系中一直添加抗生素，不利于絨毛膜干細胞的臨床應用。因此如何克服現有技術的不足是目前生物醫藥技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞均一、穩定、細胞活性好、培養周期短、可應用于臨床的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，包括以下步驟：

步驟（1），人胎盤組織的采集：人胎盤組織娩出后，用生理鹽水對胎盤組織進行清洗以除去胎盤組織周圍的血液和胎糞防止污染，然后將胎盤組織浸在胎盤保護液中，暫存于2-8℃環境中，使胎盤組織處于一個低滲、低溫的緩沖環境中，保持組織中間充質干細胞的活性；

所述的胎盤保護液為含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的1640培養基；

步驟（2），絨毛膜組織的剝離：在無菌環境下，將步驟（1）得到的浸在胎盤保護液中的胎盤組織的靠近胎兒一側的胎盤面朝上，然后剝離羊膜并暴露出羊膜下層的絨毛膜層，接著剪取臍帶周圍的絨毛膜層，并將剪取得到的絨毛膜組織置于0.9%氯化鈉注射液中；

步驟（3），絨毛膜組織的洗滌與消毒：先用0.9%氯化鈉注射液漂洗步驟（2）得到的絨毛膜組織以去除血液，并用鑷子剝去毛細血管，接著依次用含有100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的0.9%氯化鈉注射液和甲硝唑注射液浸泡絨毛膜組織，浸泡時間均為5-10分鐘，最后再用0.9%氯化鈉注射液清洗絨毛膜以去除殘留的青霉素、鏈霉素和甲硝唑注射液，達到即有效防止污染又清除抗生素的殘留；

步驟（4），絨毛膜組織的剪碎：將經步驟（3）清洗得到的絨毛膜組織放入無菌容器內，并加入間充質干細胞無血清培養基，使間充質干細胞處于溫和的環境中，按照每10g絨毛膜組織加入1-2ml間充質干細胞無血清培養基，然后用無菌剪刀將絨毛膜剪成1mm³大小的組織塊；