[發明專利]一種人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201610166682.2
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105713871A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 閆姍姍;李一佳;甘明川;莫春紅
• 申請（專利權）人: 云南舜喜再生醫學工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

1.一種人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟（1），人胎盤組織的采集：人胎盤組織娩出后，用生理鹽水對胎盤組織進行清洗以除去胎盤組織周圍的血液和胎糞，然后將胎盤組織浸在胎盤保護液中，暫存于2-8℃環境中；

所述的胎盤保護液為含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的1640培養基；

步驟（2），絨毛膜組織的剝離：在無菌環境下，將步驟（1）得到的浸在胎盤保護液中的胎盤組織的靠近胎兒一側的胎盤面朝上，然后剝離羊膜并暴露出羊膜下層的絨毛膜層，接著剪取臍帶周圍的絨毛膜層，并將剪取得到的絨毛膜組織置于0.9%氯化鈉注射液中；

步驟（3），絨毛膜組織的洗滌與消毒：先用0.9%氯化鈉注射液漂洗步驟（2）得到的絨毛膜組織以去除血液，并用鑷子剝去毛細血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的0.9%氯化鈉注射液浸泡絨毛膜組織，接著用甲硝唑注射液浸泡絨毛膜組織，浸泡時間均為5-10分鐘，最后再用0.9%氯化鈉注射液清洗絨毛膜以去除殘留的青霉素、鏈霉素和甲硝唑注射液；

步驟（4），絨毛膜組織的剪碎：將經步驟（3）清洗得到的絨毛膜組織放入無菌容器內，并加入間充質干細胞無血清培養基，按照每10g絨毛膜組織加入1-2ml間充質干細胞無血清培養基，然后用無菌剪刀將絨毛膜剪成1mm³大小的組織塊；

步驟（5），人絨毛膜間充質干細胞原代培養：將步驟（4）得到的絨毛膜組織塊均勻的平鋪于細胞培養瓶中，然后置于細胞培養箱內靜置30-60min，之后向細胞培養瓶中添加間充質干細胞無血清培養基，使培養基剛好沒過絨毛膜組織塊，接著于5%CO₂、37℃的細胞培養箱中靜止培養，6-8天后，可見組織塊周圍有細胞長出，即人絨毛膜間充質干細胞；

步驟（6），人絨毛膜間充質干細胞傳代培養：待長出細胞匯合率達50-60%時對人絨毛膜間充質干細胞進行傳代培養，棄培養基，加入重組細胞胰酶溶液消化細胞，待細胞消化完全后，加入是本步驟所用重組細胞胰酶溶液體積5倍的間充質干細胞無血清培養基，以終止重組細胞胰酶作用，然后離心去除上清液，之后加入間充質干細胞無血清培養基重懸細胞，并移至新的培養瓶中置于5%CO₂、37℃的細胞培養箱中培養；

步驟（7），人絨毛膜間充質干細胞的凍存：當步驟（6）培養的細胞匯合率達90%后進行細胞凍存，先用重組細胞胰酶溶液將細胞消化成單個細胞后，再加入是本步驟所用重組細胞胰酶溶液體積5倍的間充質干細胞無血清培養基終止重組細胞胰酶溶液作用，離心去除上清液，用含有體積分數為20%凍存保護劑的間充質干細胞無血清培養基重懸細胞，重懸混勻后，將重懸溶液置于凍存管中；

步驟（8），凍存細胞緩慢降溫：將步驟（7）得到的凍存管置于含有異丙醇的凍存盒中，-80℃冰箱過夜放置，第二天轉入-196℃液氮罐中長期儲存；

步驟（9），凍存細胞的復蘇：從步驟（8）的液氮罐中取出凍存管后，置于37℃水浴鍋中迅速融化，1200-1800rpm離心5min，去除含有凍存保護劑的間充質干細胞無血清培養基，加間充質干細胞無血清培養基重懸細胞并將重懸溶液移至細胞培養瓶中，于5%CO₂、37℃細胞培養箱靜置培養，第二天顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，若細胞已經貼壁說明細胞復蘇成功，然后更換新的間充質干細胞無血清培養基，于5%CO₂、37℃細胞培養箱繼續培養。

2.根據權利要求1所述的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（1）所述的暫存于2-8℃環境中的時間不能超過24h。

3.根據權利要求1所述的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（7）所述的凍存保護劑為DMSO和右旋糖酐細胞凍存混合液。

4.根據權利要求1所述的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（7）所述的將重懸溶液置于凍存管中時，采用規格為2ml的凍存管，每個凍存管中加入重懸溶液1.5-1.8ml。

5.根據權利要求1所述的人絨毛膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（6）和步驟（7）中用重組細胞胰酶溶液消化細胞前，先用PBS清洗細胞以除去培養基。