[發明專利]摻雜熒光標記生物高聚物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610166061.4
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN107219356A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 安婧;李瀚;鄧橙;雷霆
• 申請（專利權）人: 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;北京深邁瑞醫療電子技術研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N15/14
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及熒光標記檢測技術領域，具體地，涉及摻雜熒光標記生物高聚物及其制備方法和應用。

背景技術

熒光標記抗體試劑是一種重要的生物學/醫學檢測試劑，其熒光檢測原理是：抗體與待測樣品中的抗原特異性結合后，用特定波長的激發光照射樣品，激發抗體上標記的熒光素，然后檢測熒光素發射的熒光。熒光的波長與激發光有一定差異(一般大于激發光)，因此可以用濾光片或單色器將熒光與激發光分離，實現高信噪比的檢測。運用此原理的檢測儀器有流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光光譜儀等；檢測方法有流式細胞術、免疫熒光成像等。

熒光檢測的一個特點和優勢是，可以對同一樣品進行多通道檢測。即用超過2種抗體與樣品進行反應，不同抗體上標記不同熒光素，而這些熒光素可以被相同或不同的激發光激發，發射出不同波段的熒光，用濾光片或單色器將不同波段熒光分離后進行檢測，可以獲得樣品中多種抗原的相關信息。

隨著熒光檢測技術的不斷發展，更多參數檢測成為了科研或臨床應用的新需求，參數的增多需要更多的檢測通道以及更多種類熒光素的支持，且這些熒光素應能夠被同一波長的激發光激發以簡化儀器配置并降低儀器成本。

然而，目前的多種熒光素支持的多通道熒光檢測技術仍有待進一步研究。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種制備過程簡單，成本低，且回收率高，推廣應用價值高的摻雜熒光標記生物高聚物以及利用其的多通道熒光檢測手段。

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

針對多種熒光素支持的多通道熒光檢測技術，目前流式廠商為多參數分析所提供的熒光素除常規的FITC、PE等熒光素外，串聯熒光素(tandem dye)成為了一種很好的選擇。例如，Cyanine7熒光素本身不能被480～540nm或630nm的激發光激發；但將Cyanine7與PE或APC串聯后形成PE-Cyanine7或APC-Cyanine7串聯熒光素，則PE-Cyanine7與PE都可以被480～540nm的激發光激發，PE-Cyanine7發射Cyanine7的熒光，可以與PE組成2個檢測通道；APC-Cyanine7與APC都可以被630nm的激發光激發，APC-Cyanine7發射Cyanine7的熒光，可以與APC組成2個檢測通道。

串聯熒光素形成熒光依據據熒光共振能量轉移原理(Fluorescence/Resonance Energy Transfer，FRET)，即當一種熒光素(能量供體donor)的發射光譜與另一種熒光素(能量受體acceptor)的激發光譜重疊或更偏短波方向，被激發光照射的供體可能以非輻射方式將能量轉移給受體，受體接受能量發射熒光。

但是，目前串聯染料依賴于熒光蛋白如PE、APC等作為供體，且制備熒光標記抗體的過程比較復雜：首先要將受體與供體熒光蛋白共價偶聯，第二步將結合受體的熒光蛋白純化得到串聯熒光素，第三步將串聯熒光素和抗體分別用雙功能試劑或二硫鍵還原劑活化，第四部將抗體與串聯熒光素偶聯，最后純化得到偶聯產物。并且，依賴熒光蛋白的串聯染料標記抗體生產成本昂貴，原因是：1、熒光蛋白需從藻類中提取和純化,成本遠超化學合成制備的熒光素高；2、制備步驟復雜，原材料損失大。3.熒光蛋白分子空間位阻大，與抗體標記的偶聯產率低，導致抗體整體回收率低。

而發明人發現，理論分析和實驗顯示，受體和供體無需預先共價偶聯結合成一個“串聯熒光素”，只要其空間位置足夠近就可能發生FRET。并且FRET現象并不依賴于熒光蛋白，小分子熒光素之間也可以產生FRET能量轉移。當一種熒光團(受體)的激發光譜與另一種熒光團(配體)的發射光譜存在重疊，并且這兩種熒光團之間的距離小于10nm時，這兩個熒光團之間可能發生非輻射的FRET作用；而當兩種熒光距離較遠時，不會發生FRET作用。由此，發明人發現，將適于發生熒光共振能量轉移的多種熒光素同時標記在同一個抗體分子上，能夠基于FRET作用開發出新的熒光標記抗體，其性能與串聯熒光素標記的抗體類似，即可以與熒光供體共用一種波長的激發光，而可以發射熒光受體的熒光，應用于熒光檢測時，能夠拓寬熒光標記物種類的選擇空間，增加實驗設計的靈活性，并降低對檢測儀器的要求，但相對于串聯熒光素制備過程簡單，成本大大降低。