[發明專利]測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法

有效

• 申請號: 201610165049.1
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105784904B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 劉玉峰;李勝男;朱美霞;韓彬;王志萍;胡延喜;盧曉丹
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 胡洋

1.測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)蟲草素肝微粒體的溫孵培養

在培養瓶中加入肝微粒體、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl₂后，補加三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液配成肝微粒體孵育體系；在37℃全溫振蕩器溫孵2-5min，再定量加入蟲草素的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液，開始反應，30min后將培養瓶從全溫振蕩器中取出，迅速加入冷的有機溶劑A終止代謝反應，得溫孵產物；

2)樣品處理

將溫孵產物渦旋振蕩30s，5000r/min離心10min，準確吸取上清液，在氮氣下吹干后得殘留物；殘留物用甲醇復溶，渦旋振蕩后，5000r/min離心10min，吸取上清液，上清液過0.22μm微孔濾膜后，進樣10μL，進行液質檢測；

3)樣品分析

進行肝微粒體中蟲草素代謝物測定，具體條件如下：

色譜條件：

色譜柱：Diamonsil^TM ODS C₁₈；流動相：甲醇:水＝15:85；洗脫時間：t＝32min；進樣量：10μL；檢測波長：λ＝260nm；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；

質譜條件：

一級質譜：電離模式：電噴霧電離(ESI)；掃描模式：正離子掃描；電噴霧電壓：4.0bar；干燥氣流速：10L/min；干燥氣溫度：200℃；

二級質譜：電離模式：電噴霧電離(ESI)；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣：氮氣；毛細管電壓：2.8kV；錐孔電壓：3.0V；源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：10L/min；碰撞能量：15-25eV。

2.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：所述步驟1)有機溶劑A為甲醇或乙腈，其加入量體積為反應體系的2-4倍。

3.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：所述步驟3)中色譜柱型號為Diamonsil^TM ODS C₁₈，色譜柱250mm×4.6mm，5μm。

4.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：步驟1)中三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液的pH為7.4。

5.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：步驟1)孵育體系中肝微粒體的濃度范圍為2.0-4.0mg/mL、NADP的濃度范圍為0.5-1.0mmol/L、NADH的濃度范圍為0.5-1.0mmol/L、G-6-P濃度為10mmol/L、G-6-P DH的濃度范圍為1.0-2.0IU/mL、MgCl₂的濃度為4.0mmol/L、蟲草素的濃度范圍為1.0-1.5mg/10mL。

6.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：所述肝微粒體為小鼠、大鼠或人的肝微粒體。

7.根據權利要求1所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，其特征在于：步驟1)中三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液的濃度是50mmol/L。