[發明專利]測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法

有效

• 申請號: 201610165049.1
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105784904B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 劉玉峰;李勝男;朱美霞;韓彬;王志萍;胡延喜;盧曉丹
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 胡洋

技術領域

本發明屬于醫藥檢測技術領域，具體涉及一種測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法。

背景技術

藥物進入生物體內后，在不同酶的作用下會發生一系列的氧化、還原、水解、結合等反應，肝臟是藥物發生這些代謝反應的主要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，含有參與藥物代謝的一個龐大的細胞色素P450(CYP450)酶系，大多數藥物的I相和II相代謝反應都依賴于肝臟酶系而發生(藥物的首過效應來源于此)。因此在藥物代謝領域，肝微粒體體外實驗作為體外代謝研究的一個重要組成部分越來越受到人們的重視。

蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，Bently等相繼證實蟲草素是由腺苷和有著碳支鏈的脫氧戊糖組成的一種核苷酸，因此它也被稱為3'-脫氧腺苷(3'-deoxyadenosine，3'-dA)，具有抑菌、抗腫瘤、抗炎等生物學活性，目前已經成為一個研究熱點。蟲草素的分子式為C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量為251，熔點230～231℃，紫外光最大吸收波長為259nm。蟲草素在體內大部分遵循嘌呤核苷酸代謝途徑，在腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)的作用下快速脫氨基而成為無生物活性的代謝產物—3'-脫氧次黃嘌呤核苷，其余小部分則被磷酸化為三磷酸蟲草素(可能為蟲草素具有生物活性的成分)(Agarwal RP,Sagar SM,Parks RE.Jr Biochem Pharmacol,1975,24(6):693-701；YUNG-JEN TSAI,LIE-CHWEN LIN,TUNG-HU TSAI.Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin,a Bioactive Constituent of Cordyceps sinensis in Rat,J.Agric.Food Chem.2010,58,4638-4643)。目前，對于蟲草素的研究，多集中在提取純化工藝和藥理活性研究，迄今為止，未見以肝微粒體為模型的體外代謝研究。

發明內容

本發明目的是針對現有研究的空缺，提供測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用檢測方法，該方法具有操作簡便，樣品處理簡單、分析速度快、特異性強、靈敏度高的優點。為研究蟲草素在肝微粒體中的體外代謝產物提供技術支持，同時為研究蟲草素的體內外代謝研究奠定方法學基礎，具有重要意義。

本發明采用的技術方案為：

測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，包括以下步驟：

1)蟲草素肝微粒體的溫孵培養

在培養瓶中加入肝微粒體、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl₂后，補加三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液配成肝微粒體孵育體系；在37℃全溫振蕩器溫孵2-5min，再定量加入蟲草素三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液，開始反應，30min后將培養瓶從全溫振蕩器中取出，迅速加入冷的有機溶劑A終止代謝反應，得溫孵產物；

2)樣品處理

將溫孵產物渦旋振蕩30s，5000r/min離心10min，準確吸取上清液，在氮氣下吹干后得殘留物；殘留物用甲醇復溶，渦旋振蕩后，5000r/min離心10min，吸取上清液，上清液過0.22μm微孔濾膜后，進樣10μL，進行液質檢測；

3)樣品分析

進行肝微粒體中蟲草素代謝物測定，具體條件如下：

色譜條件：

色譜柱：Diamonsil^TM ODS C₁₈；流動相：甲醇:水＝15:85；洗脫時間：t＝32min；進樣量：10μL；檢測波長：λ＝260nm；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；

質譜條件：

一級質譜：電離模式：電噴霧電離(ESI)；掃描模式：正離子掃描；電噴霧電壓：4.0bar；干燥氣流速：10L/min；干燥氣溫度：200℃；

二級質譜：電離模式：電噴霧電離(ESI)；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣：氮氣；毛細管電壓：2.8kV；錐孔電壓：3.0V；源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：10L/min；碰撞能量：15-25eV。

所述的測定肝微粒體中蟲草素代謝物的液質聯用方法，所述步驟1)有機溶劑A為甲醇或乙腈，其加入量體積為反應體系的2-4倍。