[發明專利]一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法

有效

• 申請號: 201610164348.3
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105695409B
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 崔淑芳;楊文靜;孫偉;湯球
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，包括以下步驟：

A、收集裸鼴鼠大腦皮層混合膠質細胞：

分離出生1-7天裸鼴鼠大腦皮層組織，將組織剪碎，加入消化液混勻之后，將其放入三氣培養箱中消化；用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將細胞沉淀重懸并吹打成單細胞懸液；將單細胞懸液種于包被有左旋多聚賴氨酸的培養瓶中；

B、裸鼴鼠大腦皮層混合神經細胞的培養：

將步驟A得到的混合神經細胞，用混合神經細胞培養基中培養于三氣培養箱中25--30天；自混合神經細胞接種之后，每7天采取半量換液的方法更換混合神經細胞培養基；

C、裸鼴鼠少突膠質前體細胞的分離及純化培養：

將步驟B培養的混合神經細胞恒溫震蕩搖床中培養，恒溫35±2℃，將震蕩培養的細胞懸液置于未包被有左旋多聚賴氨酸的培養皿中使細胞貼壁，小心吸取上清，并將上清中的細胞種于包被有左旋多聚賴氨酸的培養皿中；待其貼壁后，用添加B104條件上清的少突膠質前體細胞增殖培養基進行純化培養；

所述的少突膠質前體細胞增殖培養基為Neurobasal和B27；

所述的混合神經細胞培養基為含體積分數為15％胎牛血清的低糖DMEM；

所述的三氣培養箱的參數設置為：溫度控制在35±2℃，氧濃度為5％，二氧化碳濃度為5±1％，濕度為96±2％；

步驟C中，所述震蕩培養時間為20小時；所述恒溫震蕩搖床轉速為200rpm；恒溫震蕩培養過程中保持培養瓶口旋緊以減少瓶內外空氣交換；

步驟C中，所述B104條件上清的收集是利用神經母細胞瘤B104細胞培養于二氣培養箱中，利用混合神經細胞增殖培養基進行培養，待細胞生長至80％融合度時，換為Neurobasal/B27培養基培養48小時，隨后收集上清并用0.22μm濾器過濾后置于-70℃保存備用；所述二氣培養箱參數設置為：37℃，21％氧氣濃度，5％二氧化碳濃度，以及96％濕度；所述混合神經細胞增殖培養基為含有體積分數為15％胎牛血清的低糖DMEM。

2.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，所述的消化液含有質量濃度為0.125％的胰酶和/或終濃度為0.2mg/ml的DNA酶I。

3.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，所述的少突膠質前體細胞增殖培養基為Neurobasal和B27以體積比為50:1的組合。

4.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，步驟A中，取出生1-7天裸鼴鼠大腦，剝除腦膜后分離皮層組織，用顯微剪將組織剪碎至1mm³，加入消化液混勻之后，將其放入37℃培養箱中消化；消化條件為：胰酶質量濃度為0.125％，DNA酶I終濃度為0.2mg/ml，時間為30分鐘；然后用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將細胞沉淀重懸并吹打成單細胞懸液；隨后將單細胞懸液種于包被有左旋多聚賴氨酸的T25培養瓶中。

5.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，步驟A中，所述左旋多聚賴氨酸濃度為0.01mg/ml。

6.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，步驟A中，所述離心參數設置為室溫下，800rpm，5分鐘。

7.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠少突膠質前體細胞培養方法，其特征在于，步驟B中，用混合神經細胞培養基中培養于三氣培養箱中28天。