[發明專利]一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法

有效

• 申請號: 201610164067.8
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105734133B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 程起群;逄嬌慧;全為民;呂浩;徐亞巖
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

本發明涉及一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，包括：提取近江牡蠣和熊本牡蠣的基因組DNA；利用上游引物和下游引物對基因組DNA進行PCR擴增，得到目的片段的PCR產物；其中，上游引物為5’?GTTCCGTTCCATCCTTAT?3’，下游引物為5’?AGACCACTTATCCCTCCA?3’；將PCR產物直接進行凝膠電泳，根據得到的PCR產物條帶并結合測序的結果，來判斷物種類別。本發明的方法操作簡便、成本低、耗時短、準確率高，在水產養殖、資源調查、環境保護中發揮重要作用。

技術領域

本發明屬于牡蠣近緣物種鑒定技術領域，特別涉及一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法。

背景技術

牡蠣礁是由大量牡蠣聚集生長于硬底物表面所形成的一種生物礁系統，它廣泛分布于溫帶河口和濱海區。牡蠣礁恢復是養護近岸漁業資源、修復近岸漁業水域生態系統的重要手段之一。近江牡蠣(Crassostrea ariakensis)和熊本牡蠣(Crassostrea sikamea)共存分布于長江口、杭州灣及江蘇沿岸，是我國東海區的主要造礁牡蠣物種。但針對特殊的區域選擇哪種牡蠣開展牡蠣礁恢復工程可以達到更好的生態恢復效果尚屬未知。而兩者的物種鑒別，是開展生態修復的前提。另外，牡蠣是國內外主要的經濟貝類之一，營養價值和經濟價值頗高。牡蠣養殖是貝類養殖業中的支柱產業。

由于牡蠣貝殼的形態可塑性強，易受環境影響，因此，僅憑外部形態有時很難區分具體種類，尤其牡蠣幼體和稚貝更是如此。這既是貝類分類學上的一個難題，也對牡蠣養殖、野外資源保護和可持續開發利用、以及生態修復工作不利。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，該方法操作簡便、成本低、耗時短、準確率高。

本發明的一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，包括：

(1)提取近江牡蠣和熊本牡蠣的基因組DNA；

(2)利用上游引物和下游引物對步驟(1)中的基因組DNA進行PCR擴增，得到目的片段的PCR產物；其中，上游引物為5’-GTTCCGTTCCATCCTTAT-3’，下游引物為5’-AGACCACTTATCCCTCCA-3’；

(3)將步驟(2)中的PCR產物直接進行凝膠電泳，根據得到的條帶初步判斷兩個物種的有無，進一步結合測序結果準確鑒別這兩個物種的類別。

所述步驟(1)中基因組DNA為近江牡蠣和熊本牡蠣肌肉組織中總基因組DNA；提取方法為酚-氯仿法提取。

所述酚-氯仿法為經典的酚-氯仿法，具體為：

(1)消化前的處理。

用濾紙吸干樣品中的液體，取適量背部組織加至相應的離心管中，加入1000μL的終濃度1mol/L的Tris-Cl(pH＝8.0)于離心管中，用滅菌的手術剪充分剪碎，室溫放置1h。4℃，12000rpm/min，離心10min。去上清液。

(2)消化。

分別向離心管中，加600μL的Tris buffer，50μL的10％的SDS，10μL的蛋白酶K，于振蕩儀上振蕩混勻。置于56℃水浴鍋中，水浴過程中多次人工混勻，直至消化至澄清。

(3)DNA的抽提及純化。

加飽和苯酚(Phenol saturated)350μL，350μL氯仿/異戊醇(25:24:1)，顛倒搖勻10min。4℃，12000rpm/min，離心10min。取上清液。重復上述步驟，進行第二次抽提。取上清液。加等體積的氯仿/異戊醇，混勻10min。4℃，12000rpm/min，離心10min。取上清液。

(4)DNA的沉淀及干燥。