[發(fā)明專利]一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610164067.8
• 申請(qǐng)日: 2016-03-22
• 公開（公告）號(hào): CN105734133B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程起群;逄嬌慧;全為民;呂浩;徐亞巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

1.一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，包括：

(1)提取近江牡蠣和熊本牡蠣的基因組DNA；

(2)利用上游引物和下游引物對(duì)步驟(1)中的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；其中，上游引物為5’-GTTCCGTTCCATCCTTAT-3’，下游引物為5’-AGACCACTTATCCCTCCA-3’；

(3)將步驟(2)中的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)得到的條帶初步判斷兩個(gè)物種的有無，進(jìn)一步結(jié)合測(cè)序結(jié)果鑒別這兩個(gè)物種的類別；PCR產(chǎn)物條帶中近江牡蠣的目的片段為1506±2bp，熊本牡蠣目的片段為1576±2bp，兩者相差70±4bp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(1)中基因組DNA為近江牡蠣和熊本牡蠣肌肉組織中總基因組DNA；提取方法為酚-氯仿法提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR反應(yīng)體系包括以下成分：100ngDNA模板，dNTPs終濃度0.2mmol/L，引物終濃度各0.4umol/L，MgCl₂終濃度2.0mmol/L，12.5μL 2×reactionbuffer，1.25U Taq聚合酶，然后加去離子水至終體積25μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；接下來為37個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸8min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于線粒體特異片段的近江牡蠣和熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(3)中凝膠電泳為1.4％的瓊脂糖凝膠電泳。