[發明專利]一種真菌菌絲總DNA提取液及提取真菌菌絲總DNA的方法

有效

• 申請號: 201610163675.7
• 申請日: 2016-03-20
• 公開（公告）號: CN105602941B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 郭巍;畢揚;張艷杰;李亞寧;趙丹;張汀;劉大群;楊寶東;陳艷
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京聿華聯合知識產權代理有限公司11611
• 代理人: 劉烽

技術領域

本發明屬于真菌菌絲總DNA提取的技術領域，特別涉及一種真菌菌絲總DNA提取液及提取真菌菌絲總DNA的方法。

背景技術

在真菌的分子生物學研究中，真菌總DNA的提取至關重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步驟大體相似，關鍵在于如何有效地破碎細胞壁，有的是通過機械來進行破碎細胞壁，有的是通過酶等物質來消化去壁。由于真菌細胞壁上富含多糖等物質，因此即使是液氮冷凍干燥研磨后也很難被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事實上，目前大部分實驗室所采用的破壁方法均是液氮冷凍干燥研磨，但是這些方法大多會用到有毒有機溶劑、酚等，而且操作時間較長，步驟較多。另外，使用液氮研磨容易凍傷皮膚，需要強力研磨，費時費力，受研缽數量的限制容易產生交叉污染，在研磨過程中真菌菌絲也容易損失，效率也不高，特別是一些單位和機構由于液氮及干冰不易獲取而使其受到嚴重限制。

因此急需一種操作簡便且適于DNA微量提取以用于直接進行PCR擴增的技術。

發明內容

針對上述問題，本發明開發了一種真菌菌絲總DNA提取液，其包括提取液I和提取液II；其中所述提取液I包括緩沖鹽、非離子表面活性劑、以及中性鹽的水溶液，其pH值為7.5-8.5，特別是其pH值可以為7.8-8.2；所述提取液II包括緩沖鹽和陽離子表面活性劑，其pH值為7.5-8.5，特別是其pH值可以為7.8-8.2。

使用本發明的真菌菌絲總DNA提取液，可以取得如下的有益效果：

1）實現簡化真菌菌絲總DNA提取步驟的目的；

2）適用于真菌菌絲總DNA微量提取，這為難于獲得或僅能獲得小量的實驗材料提供了有效的實驗手段；

3）避免了有毒有機溶劑、酚等的使用；

4）可以簡化操作步驟，減少操作時間；

5）還避免了液氮研磨過程中容易造成凍傷皮膚的可能性。

在一個具體實施例中，所述陽離子表面活性劑為陽離子聚丙烯酰胺。其濃度可以為0.1-5 ppm，特別是1-3 ppm。

在一個具體實施例中，所述非離子表面活性劑為醇醚硫酸鹽；優選地為脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉；更優選地為C12～C18的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉；最優選地為C12～C15的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉。

在一個具體實施例中，所述緩沖鹽選自Tris-HCl、磷酸鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種。

在一個具體實施例中，所述緩沖鹽的濃度為100-200 mM，優選為150-200 mM。

在一個具體實施例中，所述中性鹽為氯化鹽；優選地，所述氯化鹽為氯化鈉和/或氯化鉀。

在一個具體實施例中，所述中性鹽的濃度為100-200 mM，優選為150-200 mM。

在一個具體實施例中，所述真菌為白粉病菌（Cicinnobolus cesatii）。

本發明還提供了一種提取真菌菌絲總DNA的方法，包括如下步驟：

（1）收集真菌菌絲體；

（2）將真菌菌絲體置于如上所述的提取液I；

（3）凍融至少1次，優選凍融至少2次，更優選凍融至少3次；

（4）加入如上所述的提取液II；

（5）去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。

在一個具體實施例中，以體積計，所述提取液I與所述提取液II的比例為10:(1-5)，優選10:(1.5-2.5)。

在一個具體實施例中，在步驟（3）中，冷凍的溫度為零下196°C至零下20°C，融化的溫度為40°C至70°C；優選所述冷凍的溫度為零下196°C，融化的溫度為50°C至60°C。至于凍融的時間，可長可短，一般來講以能夠凍住或解凍即可。

在一個具體實施例中，以離心的方式去除所述不溶物，優選離心速度為10000-15000 rpm，離心時間為1-5分鐘。在通過離心去除不溶物后，可以直接使用獲得的上清液用于下一步實驗操作，例如普通的PCR擴增、RT-PCR擴增等實驗。

在一個具體實施例中，還包括步驟（6）將所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE緩沖液中或去離子水中。經過該處理后，將將提取的DNA長期的冷凍保存，以備后續實驗使用。

附圖說明