技術領域
本發明涉及克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的引物及克隆方法，克隆甘薯病毒C全長基因組序列的引物及克隆方法和同時克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系和甘薯病毒C全長基因組序列的引物及克隆方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術
甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)和甘薯病毒C(Sweet potato virus C，SPVC)是危害甘薯的主要病毒，兩種病毒均屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，田間常常混合侵染甘薯，并且可與甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)協生引起甘薯復合病毒病SPVD(sweet potato virus disease，SPVD)的發生，造成甘薯產量嚴重降低，品質變劣和種性退化，對甘薯生產造成嚴重危害。
克隆病毒基因組的全長基因組序列，能夠進一步研究病毒基因組的結構和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途徑。但是由于SPFMV和SPVC常混合侵染甘薯，分離純化極為困難，而且兩種病毒在甘薯體內含量較低，因此利用純化病毒的常規克隆方法很難獲得病毒全長基因組序列。截止目前，尚未見SPFMV和SPVC中國分離物全長基因組序列的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系和甘薯病毒C全長基因組序列的引物，分別為克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系引物、克隆甘薯病毒C全長基因組序列的引物和同時克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系和甘薯病毒C全長基因組序列的引物，同時還提供相應的克隆方法，解決了現有技術利用純化病毒的常規克隆方法很難獲得病毒全長基因組序列的技術問題。
為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是提供克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的引物，包括三對引物，分別為引物對1-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPFMV-O-4160-F和SPFMV-O-5284-R，具體的核苷酸序列如下：
1-F：5’-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3’
4711-R：5’-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3’
4689-F：5’-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3’
10380-R：5’-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3’
SPFMV-O-4160-F：5’-AAGCGACAGAGCAACAGACTTATGTACTA-3’
SPFMV-O-5284-R：5’-GATATTGCGTTGTAAATTCAACCTCACGTC-3’
其中，W＝A或T，Y＝C或T，R＝A或G，S＝C或G。
本發明所采用的技術方案還在于提供一種克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的方法，包括以下步驟：
(1)提取同時感染甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯病毒C和甘薯褪綠矮化病毒的甘薯植株葉片的總RNA，作為反轉錄模板進行反轉錄；
(2)以步驟(1)得到的反轉錄產物作為模板，利用引物對1-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPFMV-O-4160-F和SPFMV-O-5284-R，分別進行PCR擴增，對應的預期擴增片段大小分別為片段1 4.7kb、片段2 5.7kb和片段3 1.2kb；
(3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，將符合預期擴增片段大小的PCR擴增產物進行回收純化，分別與pMD19-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌TG1，將大腸桿菌TG1菌液PCR鑒定獲得陽性克隆，對陽性克隆進行測序和比對分析，得到包含甘薯羽狀斑駁病毒O株系的基因組序列的片段1、片段2和片段3；拼接，得到甘薯羽狀斑駁病毒O株系的全長基因組序列。
步驟(1)中反轉錄的反應體系為10μl，包括：總RNA 5.75μL、5×RT Buffer2μl、10μmol/L的Oligo dT引物0.5μL、10mmol/L的dNTPs 1μL、40U/μl的RNase抑制劑0.25μL和5U/μl的AMV反轉錄酶0.5μL。
反轉錄的反應程序為：42℃反轉錄60min，99℃5min，5℃5min。
