[發明專利]克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系和甘薯病毒C全長基因組序列的引物及克隆方法

有效

• 申請號: 201610160979.8
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN105695456B
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 秦艷紅;張振臣;喬奇;張德勝;王永江;田雨婷;王爽;渠瑞娜
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/40
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙)41122
• 代理人: 張愛軍

1.克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的引物，其特征在于，包括三對引物，分別為引物對1-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPFMV-O-4160-F和SPFMV-O-5284-R，具體的核苷酸序列如下：

1-F：5’-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3’

4711-R：5’-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3’

4689-F：5’-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3’

10380-R：5’-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3’

SPFMV-O-4160-F：5’-AAGCGACAGAGCAACAGACTTATGTACTA-3’

SPFMV-O-5284-R：5’-GATATTGCGTTGTAAATTCAACCTCACGTC-3’

其中，W＝A或T，Y＝C或T，R＝A或G，S＝C或G。

2.一種利用權利要求1所述的引物克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取同時感染甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯病毒C和甘薯褪綠矮化病毒的甘薯植株葉片的總RNA，作為反轉錄模板進行反轉錄；

(2)以步驟(1)得到的反轉錄產物作為模板，利用引物對1-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPFMV-O-4160-F和SPFMV-O-5284-R，分別進行PCR擴增，對應的預期擴增片段大小分別為片段1 4.7kb、片段2 5.7kb和片段3 1.2kb；

(3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，將符合預期擴增片段大小的PCR擴增產物進行回收純化，分別與pMD19-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌TG1，將大腸桿菌TG1菌液PCR鑒定獲得陽性克隆，對陽性克隆進行測序和比對分析，得到包含甘薯羽狀斑駁病毒O株系的基因組序列的片段1、片段2和片段3；拼接，得到甘薯羽狀斑駁病毒O株系的全長基因組序列。

3.根據權利要求2所述的克隆甘薯羽狀斑駁病毒O株系全長基因組序列的方法，其特征在于，

步驟(1)中反轉錄的反應體系為10μl，包括：總RNA 5.75μL、5×RT Buffer 2μl、10μmol/L的Oligo dT引物0.5μL、10mmol/L的dNTPs 1μL、40U/μl的RNase抑制劑0.25μL和5U/μl的AMV反轉錄酶0.5μL；

反轉錄的反應程序為：42℃反轉錄60min，99℃5min，5℃5min；

步驟(2)中PCR的反應體系為50μl，包括：10×PCR Buffer 5μL、2.5mmol/L的dNTPs 4μL、10μmol/L的上下游引物各1μL、5U/μL的LA Taq酶0.5μL、反轉錄產物2.5μl，余量為ddH₂O；

PCR的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，根據目的條帶大小，按照1kb/min計算延伸時間，72℃延伸1-6min，完成35個循環，最后72℃延伸10min。

4.克隆甘薯病毒C全長基因組序列的引物，其特征在于，包括三對引物，分別為引物對1-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPVC-4110-F和SPVC-5209-R，具體的核苷酸序列如下：

1-F：5’-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3’

4711-R：5’-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3’

4689-F：5’-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3’

10380-R：5’-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3’

SPVC-4110-F：5’-ACTGCATTACACACAAAGAGTGTAGCATTG-3’

SPVC-5209-R：5’-ATGATGAATTCATATTCGCGTAACTGCTCAG-3’

其中，W＝A或T，Y＝C或T，R＝A或G，S＝C或G。