[發明專利]一種識別糖的快速方法

有效

• 申請號: 201610160329.3
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN105699478B
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 楊洪梅;石磊;蘇蕊;連文慧;李金英;劉淑瑩
• 申請（專利權）人: 長春中醫藥大學
• 主分類號: G01N27/68
• 分類號: G01N27/68;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及PMP(1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮)衍生化結合離子淌度串聯質譜(IM?MS/MS)的方法，其解決了現有識別寡糖異構體技術中，無法簡單、快速、準確的分析實際混合的糖樣品的問題，同時解決了利用質譜手段無法確定糖的單糖殘基組成的問題。本發明對比了PMP和苯肼(PHN)為衍生化試劑結合IM?MS/MS方法對糖的異構體進行識別的效果，并從理論上對衍生化產物的碰撞截面(CCS)值進行了計算，進一步證實用PMP衍生化結合IM?MS/MS方法可成功對糖的混合提取物進行定性鑒定，并且可同時鑒定糖的連接、構型和組成。

技術領域

本發明屬于分析化學領域，涉及PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化結合離子淌度串聯質譜（IM-MS/MS）識別糖的方法，具體而言，涉及天然產物提取物中糖結構鑒定的PMP衍生化結合離子淌度串聯質譜的方法。

背景技術

寡糖是生物體內重要的信息物質，糖在多種生物過程中起重要的作用，如抗凝活性、免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抑制致病微生物、抗氧化、抗炎活性等（X. Zhang. Curr.Med. Chem. 2006, 13, 1141-1147; S. Hakomori. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2002, 99, 225-232.）。糖的連接、構型、單糖殘基組成一直是糖的結構研究的難點，糖鏈結構的復雜性和技術手段的局限性，對糖鏈的結構的分析遠遠滯后于對其功能的研究，嚴重制約了糖鏈結構與功能關系的研究。而這種生物來源的樣品往往分離純化的難度也很大，經常得到非常微量的混合物，目前還沒有任何一種分析技術能解決以上所有問題，迫切需要建立快速、有效的方法分析糖的混合異構體。

傳統的分析寡糖的方法包括核磁共振（NMR）、氣相色譜-質譜（GC/MS）和高效液相色譜（HPLC）的結合（H. A. Currie, C. C. Perry. J. Chromatogr., A 2006, 1128, 90-96.）。但NMR靈敏度低，對樣品純度要求高，目前在天然樣品的分析中無法得到廣泛應用。HPLC法比較耗時，而且在區分異構體方面也不是特別有效。具有快速、靈敏等優點的質譜法在糖的結構分析方面起到了重要的作用，特別是IM-MS的出現。它是一種基于離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞時的碰撞截面（CCS）不同，離子可按大小和形狀進行分離的技術。IM-MS與傳統質譜最大的區別在于質譜的質量分析器之前增加了一個離子漂移管。這個漂移管中充有惰性氣體比如氮氣或者氦氣，當離子在漂移管中運動時，運動著的離子會和惰性氣體分子碰撞，即使所帶電荷相同，質量相似而形狀、尺寸不同的離子與惰性氣體碰撞時橫截面積也不相同，即離子運動的“阻力”不同，使得離子通過漂移管的時間長短不一，達到通過形狀區分離子的目的。它的快速、獨特的氣相離子分離能力使得它成為分析糖異構體的理想的工具，已成功用于糖的結構的鑒定。在負離子模式下通過添加陰離子，利用IM-MS/MS結合HPLC能夠較好的區分從牛下頜腺粘蛋白分離得到的糖異構體（H. Li, B. Bendiak, W. F.Siems, D. R. Gang and H. H. Hill. Anal. Chem. 2015, 87, 2228?2235.），但分析對象為三糖以上的連接、構型異構體，結構差別明顯。利用IM-MS分離分子量比較小的糖尚未完全分開（H. Li, K. Giles, B. Bendiak, K. Kaplan, W. F. Siems, H. H. Hill.Anal. Chem. 2012, 84, 3231-3239.）。近期發表在nature上的一篇文獻中研究者們利用IM-MS鑒定了6個三糖異構體的連接和異頭碳，但組成異構體無法進行區分（J. Hofmann,H. S. Hahm, P. H. Seeberger, K. Pagel. Nature 2015, 526, 241-244.），可見確定糖的單糖殘基組成確實是個難點。

可見，目前使用IM-MS對糖的結構鑒定一直存在較大的技術困難，即使對糖進行衍生化后，結構接近的糖分離也難以做到有效區分。研究人員一直期待找到對結構相近的糖快速有效的分析手段。