[發明專利]一種識別糖的快速方法

有效

• 申請號: 201610160329.3
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN105699478B
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 楊洪梅;石磊;蘇蕊;連文慧;李金英;劉淑瑩
• 申請（專利權）人: 長春中醫藥大學
• 主分類號: G01N27/68
• 分類號: G01N27/68;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化結合離子淌度串聯質譜識別人參中低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)氨水-甲醇溶液配制

NH₃·H₂O加入到甲醇中充分振蕩，得到濃度為0.75-0.9mol/L的氨水-甲醇溶液；

(2)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液配制

將1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮配制成濃度為0.0349mol/L的溶液，保存于4℃冰箱中備用；

(3)人參低聚糖樣品的提取、分離、富集

將干燥的人參根粉碎至50～80目，在室溫下用蒸餾水浸泡過夜，70℃下提取2～3h，四層紗布過濾，殘渣再反復提取2次；合并3次提取液，3500rpm離心15min后，棄去沉淀，合并上清液；將上清液旋轉蒸發、凍干后得到人參粗低聚糖樣品；將粗低聚糖樣品與水以質量比7：1000混合，用截留分子量為3000Da的超濾膜進行超濾分級，濾出液用苯酚-硫酸法實時監控，直到沒有顏色為止；收集濾出液，旋轉蒸發濃縮后，凍干得人參低聚糖樣品；將所得樣品溶解于水中，10000rpm離心5min后，將上清液上至平衡好的1.0cm×100cm Bio-gel P-2凝膠層析柱；然后用去離子水洗脫，流速為0.06mL/min，收集洗脫液；從每管中取出0.2mL洗脫液，用苯酚-硫酸法測定其中的糖含量，并繪制層析圖；根據洗脫曲線收集人參低聚糖樣品1和人參低聚糖樣品2的洗脫液；

(4)標準品和提取物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化過程

標準品：反應總體積為200μL，2.5mmol/L的單糖或二糖標準品，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液補足；

提取物：反應總體積為200μL，終濃度為10g/L的人參低聚糖樣品1及人參低聚糖樣品2混合物，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液補足；標準品和提取物在10000rmp離心，取上清液，于60～80℃溫水浴中反應1～2h；反應后，離心取上清液用高純N₂吹干，加Milli-Q水充分溶解后，10000rmp離心10min，取上清液加CCl₃充分振蕩，靜置后除去下層溶液，反復多次，直到下層無顏色，最終得到樣品的衍生化產物，置于4℃冰箱中；

(5)質譜條件

質譜儀：Waters Synapt G2質譜儀，離子源：電噴霧電離源正離子模式，毛細管電壓：2.8kV，樣品錐孔電壓：50V，萃取錐孔電壓：4V，源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：350℃，錐孔氣流速：30L/h，T-wave速率：550-2500m/s，T-wave高度：38～40V，漂移氣體為氮氣，流速：90mL/min，碰撞氣體為氬氣，trap碰撞能量：35～40V；標準品和提取物均按上述質譜條件進行分析。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中氨水-甲醇溶液的濃度為0.82mol/L。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液是由0.82mol/L的氨水-甲醇配制而成。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的標準品和提取物在70℃溫水浴中反應2h。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的T-wave速率為550～2500m/s，T-wave高度為40V。