[發明專利]完全不動精子的生育力保存方法

在審

• 申請號: 201610157472.7
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105660607A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 馮貴雪;陳煥華;張波;周紅;汪彩珠;舒金輝;林若蕓;甘賢優
• 申請（專利權）人: 馮貴雪;廣西壯族自治區婦幼保健院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種精子生育力保存的方法，尤其是一種完全不動精子的生育力保存方法。

背景技術

目前，精液冷凍保存技術已有200多年的歷史。人的精液冷凍保存可以追溯到20世紀 40年代末。精液冷凍保存在我國主要應用于人類精子庫以及生育能力的保存。國內外研究者 通過幾十年對精液冷凍程序、冷凍稀釋液、解凍液等的篩選，已經建立了較為成熟的精液冷 凍保存體系。全國各生殖中心對人精液冷凍保護劑的需求量比較大，而市場上人精液冷凍保 存劑幾乎全部被國外的生物公司所壟斷，國內只有部分科研院所自行配置畜禽精液冷凍保護 劑。國內還沒有自行開發的人類精液冷凍保護劑應用于臨床，并且現有的商品化的人類精液 冷凍保存系統適合于人的正常精液，對少弱精的保存效果并不理想。

精子冷凍是保存男性生育力最有效的方法，已成為人類輔助生殖技術(ART)中必不可 少的技術。許多研究表明，來源于射出、附睪穿刺(PESA)和睪丸穿刺(TESA)的精子經 冷凍保存及卵胞漿內單精子注射(ICSI)后能獲得與新鮮精子相似的臨床結局。傳統的觀點 認為，精子冷凍保存的前提需要有運動的精子。但是，對于完全不運動的精子是否有冷凍保 存價值尚不清楚。

ICSI技術是目前治療嚴重男性不育的理想手段。有報道，應用不運動精子行ICSI后可獲 得臨床妊娠并生下健康后代，然而，其受精率、胚胎發育潛能明顯低于活動精子。進一步研 究證實，不運動精子并不表明其已經死亡，其存活的精子仍具有正常的受精能力。這提示， ICSI的基礎是需要有存活的精子。那么，如何快速、準確、高效及安全地鑒別完全不動精子 中的存活狀態以確定是否適合冷凍保存及解凍后如何選擇存活精子進行受精是關鍵。WHO第 5版《人類精液檢查與處理操作手冊》中推薦低滲腫脹試驗和伊紅染色用于診斷性評估精子 的活力。然而，這兩種方法存在不足之處，前者操作較繁瑣且不適用于冷凍-解凍的精子，后 者經染色后即使鑒定為存活精子也無法再用于受精。進一步研究發現，應用激光照射精子尾 膜時，存活的精子產生突然的應急反應，精子尾部卷曲，而死精子無這種現象，并且其應用 在新鮮和凍融后的完全不動精子均有相似的現象。進一步研究證明，激光照射精子尾部對精 子頭部DNA并無損傷，并且精子尾部在受精過程中沒有實質的意義。這提示，激光可能是 一種安全有效地鑒別不動精子存活狀態的有效方法。

傳統的觀點認為，只有運動的精子適合冷凍保存。然而，有些不育患者精子的活動率極 低，甚至所有的精子都完全不運動，多見于精子原纖毛不動癥和睪丸手術取精的患者。對于 前者，臨床上常規的處理是丟棄射出的完全不動精子，擇期改行睪丸穿刺取精嘗試尋找活動 精子。對于后者，如果穿刺出來的是完全不動精子也極有可能被廢棄，擇期再行睪丸穿刺術。 重復穿刺勢必增加了患者遠期并發癥發生的機會和經濟負擔，因此，如何有效地保存這些患 者生育力是值得深思的問題。

常規的精子冷凍方法使用2ml的冷凍管，精液與冷凍液按1∶1比例稀釋后經液氮熏蒸后再 投入液氮冷凍保存。由于冷凍過程中細胞內冰晶形成等因素會導致一定程度的精子損傷，采 用目前傳統的冷凍方法凍存稀少精子復蘇率及回收率較低，復蘇后精子細胞膜損傷嚴重，導 致無法用于后續的輔助生殖治療。也有一些報道利用人類和小鼠的空透明帶冷凍稀少精子， 但人卵透明帶較難獲得，且可能存在污染的問題，難以推廣應用。冷凍環也有被應用于稀少 精子冷凍，但精子加載難度較大。臨床上，往往有些患者獲取的精子活力甚微，甚至完全不 動。因此，需迫切尋求一種穩定、高效的冷凍完全不動精子癥患者生育力的方法。

理論基礎：

精子膜完整性與精子代謝、頂體反應、精子獲能及精卵融合密切相關。此外，精子膜功 能完整性還與受精卵著床、胚胎植入密切相關。精子尾部細胞膜屬于半透膜，具有自動調節 膜內外滲透壓平衡的能力。激光具有熱效應，當低能量激光射擊活動精子尾部時，由于局部 溫度升高很可能發生蛋白質變性而導致精子尾部細胞膜的流動性、通透性改變。當激光照射 精子尾膜時，熱效應使精子尾膜內外的滲透壓不平衡，活精子的細胞膜處于完整的狀態，具 備調節細胞膜內外滲透壓平衡的能力，水分子可由膜外進入膜內；而死精子尾膜的通透性發 生改變，喪失調節膜內外滲透壓的能力，水分子無法進入膜內。激光的這一特性為胚胎學家 從完全不動精子中鑒別有活力精子用于ICSI提供了新思路。