[發明專利]一種針對前列腺特異抗原的檢測方法

有效

• 申請號: 201610156409.1
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105785019B
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 熊勇華;黃小林;許恒毅;陳銳;梁毅;湛勝楠;裴可;熊穎;段宏;鄭玲燕;周耀峰
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/573
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及抗原檢測技術領域，進一步涉及基于ELISA的抗原檢測技術，具體涉及一種針對前列腺特異抗原的檢測方法。

背景技術

近年來，隨著人們生活水平的提高、飲食結構的改變以及環境污染的加劇等，前列腺癌的發病率呈逐年上升趨勢。前列腺癌已超過皮膚癌成為北美男性最常見的癌癥，在因癌致死因素中排第二位。前列腺特異抗原(prostate specific antigen,PSA)是從前列腺組織中分離、純化的一種特異性糖蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性。PSA是目前公認的最有價值的前列腺癌標志物，它是臨床應用中特異性高、敏感性強的診斷前列腺癌不可缺少的首選TM檢測方法，對前列腺癌的診斷、療效觀察及預后監測具有十分重要的意義和作用。血清前列腺特異抗原(PSA)正常值一般<4ng/mL，當前列腺癌發生時PSA>10ng/mL，具有輔助臨床診斷的顯著意義。

早期檢測PSA的方法主要有免疫擴散、免疫電泳、火箭電泳等，但因靈敏度低、操作復雜等都已被淘汰。近年來，一系列檢測PSA的方法被確立，其中多克隆抗體放射免疫法存在靈敏度低、重復性差、線性范圍窄、費時耗力等缺點，不便于應用；酶聯免疫吸附法受基質特異性影響，測定結果存在假陰性或假陽性的情況，且靈敏度低；自動微粒酶聯免疫法測定要有專門的儀器才能完成，操作繁瑣，儀器貴重，該檢測方法的應用依然受到限制；化學發光法依賴于高純度試劑和高精度儀器，樣品前處理過程繁瑣，因此也不適于廣泛高靈敏快速檢測。聚合酶鏈式反應法測定時干擾因素影響較大，方法學本身存在缺陷，測定結果可信度不夠，靈敏度不足。然而，酶聯免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、靈敏、特異、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測等優點，已成為PSA快速篩查檢測的主要方法。現有技術中針對PSA的ELISA檢測方法普遍基于辣根過氧化物酶標記的抗體或抗原催化雙氧水生成羥自由基，進而氧化無色的化學顯色底物四甲基聯苯二胺(TMB)形成藍色產物，然后使用終止液(2M H₂SO4)終止反應形成黃色溶液于450nm處記錄吸光度值。該類方法因其顯色強度較低，因此檢測靈敏度相對較低，當待測樣品中目標物含量較低時易出現假陰性結果，從而無法滿足實際應用的要求。

因此，近年來，一些新型信號傳導機制替代傳統ELISA信號傳導機制用于提高傳統ELISA靈敏度的方法被廣泛報道，如共振酶聯免疫法、化學發光酶聯免疫法、熒光染料酶聯免疫法、熒光增強酶聯免疫法以及熒光淬滅酶聯免疫法等。其中，基于熒光底物的ELISA因其具有較高的靈敏度而受到了廣泛的關注。據報道，用熒光底物替代傳統顯色底物可以將檢測靈敏度提高至少1-2個數量級，然而發光體系的有效性不僅由底物所決定，還同檢測對象、標記物酶、檢測工藝等具有密切關系，因此在ELISA方法中引入新的發光體現需要結合具體情況進行全新設計。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種針對前列腺特異抗原的檢測方法，以解決現有技術的前列腺特異抗原ELISA檢測方法精度較低。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術用于前列腺特異抗原檢測的ELISA方法中，標記抗體的酶靈敏性較低。

本發明要解決的再一技術問題是現有技術用于前列腺特異抗原檢測的ELISA方法中，顯色系統靈敏性較低。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶對前列腺特異抗原執行ELISA檢測時，具體工藝方法并不明確。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對前列腺特異抗原執行ELISA檢測時，檢測結果與抗原濃度的線性關系不佳。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對前列腺特異抗原執行ELISA檢測時，過程中洗滌效果不佳。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種針對前列腺特異抗原的檢測方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯免疫法，該方法是針對前列腺特異抗原的檢測，該方法中用于標記抗體的酶是觸酶C100。

作為優選，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。其中雙氧水作為碲化鎘量子點熒光淬滅劑，反應過程中，雙氧水在觸酶作用下分解，從而降低熒光淬滅作用，實現發光。

作為優選，該方法包括以下步驟：

1)包被前列腺特異抗原抗體；