[發(fā)明專(zhuān)利]一種阿達(dá)木單抗的陽(yáng)離子交換色譜純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610156287.6
• 申請(qǐng)日: 2016-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105777903B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪艷;楊彬;馬旭通;林小鵲;李文佳;孫文正
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/24
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/24;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單克隆抗體制備，具體涉及一種阿達(dá)木單抗的陽(yáng)離子交換色譜純化方法。

背景技術(shù)

阿達(dá)木單抗是全球首個(gè)被批準(zhǔn)的抗腫瘤壞死因子α(TNFα)全人源單克隆抗體。阿達(dá)木單抗可阻止TNFα與其細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而阻斷TNFα的生物學(xué)活性，最終減輕炎癥反應(yīng)并減少破骨細(xì)胞激活，達(dá)到控制并緩解癥狀體征的目的。

傳統(tǒng)純化方法如中國(guó)專(zhuān)利CN 102257006 A，公開(kāi)了通過(guò)親和層析捕獲步驟分離和純化抗體的方法，Protein A柱由于選擇性高和去污染物能力強(qiáng)，經(jīng)常被首選進(jìn)行抗體捕獲，但其價(jià)格昂貴、洗脫的低pH易導(dǎo)致高分子聚合物形成、Protein A配基掉落等缺點(diǎn)，使越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注用非ProteinA工藝來(lái)解決現(xiàn)有問(wèn)題。中國(guó)專(zhuān)利CN 103998469 A公開(kāi)了用陽(yáng)離子交換柱、疏水相互作用柱和陰離子交換柱來(lái)替代Protein A柱去除抗體污染物。其中，具有改進(jìn)載量的陽(yáng)離子填料可用來(lái)處理發(fā)酵后處理的料液，但料液在加載到特定柱上后，由于污染物含量較高，吸附到色譜柱產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)會(huì)影響層析中多聚體去除，給后續(xù)純化中多聚體的去除帶來(lái)不便。中國(guó)專(zhuān)利CN 102119168 A公開(kāi)了一種使用非離子聚合物的層析步驟去除蛋白質(zhì)聚集物，隨后使用強(qiáng)化溶解的添加劑進(jìn)行離子交換層析，但使用的添加劑濃度偏高，用在抗體純化過(guò)程中，有導(dǎo)致抗體變性失活的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種能夠有效去除多聚體等污染物和穩(wěn)定樣品的阿達(dá)木單抗的純化方法。申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)，在復(fù)性過(guò)程中添加的輔助因子(如尿素和表面活性劑等低濃度變性劑)能夠通過(guò)提高折疊中間體或伸展肽鏈的延展度來(lái)抑制聚集體生成。而這些輔助因子除了能更好地去除多聚體，本身還有穩(wěn)定抗體高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，抑制多聚體的形成。因此，在色譜操作中引入多步?jīng)_洗和洗脫，并在洗脫緩沖液中加入適當(dāng)?shù)奶砑觿軌蛴兄谌コ嗑垠w等污染物和穩(wěn)定樣品。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)人提出了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種純化阿達(dá)木單抗的方法，包括對(duì)CHO細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)的抗體進(jìn)行陽(yáng)離子交換色譜洗脫、疏水作用色譜洗脫。陽(yáng)離子交換色譜的洗脫液是pH 5.5-6.5的緩沖液，共進(jìn)行2次洗脫，其中第一次陽(yáng)離子交換色譜的洗脫液中含有0.1-0.5mol/L尿素；第二次陽(yáng)離子交換色譜的洗脫液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％-1.0％的甜菜堿類(lèi)表面活性劑；所述的疏水作用色譜洗脫分為2步洗脫，其中，第一步洗脫的洗脫液為pH5.5-6.5、0.15-0.4mol/L(NH₄)₂SO₄的45mmol/L PBS緩沖液，第二步洗脫的洗脫液為pH5.5-6.5的45mmol/L PBS緩沖液。

根據(jù)上述技術(shù)方案提供的方法，在一些實(shí)施方式中，所述的甜菜堿類(lèi)表面活性劑選自十二烷基二羥乙基甜菜堿、十八烷基二羥乙基甜菜堿或椰油酰胺丙基甜菜堿。

本發(fā)明在陽(yáng)離子交換色譜的洗脫液中引入了低濃度尿素和甜菜堿。尿素一般用于包涵體復(fù)性時(shí)溶解包涵體的作用(8M)，而低濃度的尿素可使蛋白復(fù)性，有利于折疊成天然構(gòu)象。同時(shí)適當(dāng)濃度表面活性劑能與吸附劑及蛋白的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附，甜菜堿類(lèi)兩性離子表面活性劑，表面含有兩性離子基團(tuán)或陰陽(yáng)離子端基基團(tuán)混合物，帶電兩性離子官能團(tuán)的溶劑化作用和氫鍵作用能使兩性離子化合物表面形成水合層，這種基于靜電作用形成的水合層表面可有效阻抗非特異性蛋白吸附。

HIC(疏水相互作用層析)是一類(lèi)根據(jù)層析填料表面配基與蛋白質(zhì)表面疏水殘基之間的疏水性差異而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法。蛋白質(zhì)的疏水性表面殘基能夠與HIC基質(zhì)上的配基相互作用，而結(jié)合強(qiáng)度會(huì)根據(jù)表面所暴露殘基的疏水性不同而有所差別。一般情況下，疏水性作用隨離子強(qiáng)度提高而增強(qiáng)，因此在HIC過(guò)程中通常采用“高鹽吸附，低鹽洗脫”。在合適的條件下，結(jié)合的蛋白質(zhì)按照疏水性逐漸增加的趨勢(shì)洗脫。多聚體通常是多個(gè)單體蛋白質(zhì)的聚合或者涉及變性蛋白，其疏水性比單體更強(qiáng)，因而HIC可用于多聚體的去除使其在洗脫過(guò)程中更晚出峰而與單體分離。