[發明專利]一種卵巢原位注射實現RNA過表達的方法及應用

在審

• 申請號: 201610154665.7
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105779495A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 楊世華;李加宇;吳綺琪;方志浩;黃群山
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/113
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種卵巢原位注射實現RNA過表達的方法及 應用。

背景技術

至今未發現由和本發明方法相同或類似的報道。

發明內容

為克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種卵巢原位注射實 現RNA過表達的方法。本發明通過體內轉染的方法實現RNA在小鼠卵巢中的過表達，為進一 步研究RNA在卵巢中的功能提供技術支持。

本發明的另一目的在于提供上述的卵巢原位注射實現RNA過表達的方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種卵巢原位注射實現RNA過表達的方法， 操作步驟如下：

(1)轉染復合物配制，包括lncRNA重組載體稀釋液和轉染試劑稀釋液：

所述的lncRNA重組載體稀釋液：

1ug/ul的lncRNA重組載體：6.25ul；

10％葡萄糖溶液3.125μl；

水3.125μl；

所述的轉染試劑稀釋液：

轉染試劑6.25μl；

10％葡萄糖溶液6.25μl；

(2)體內轉染實驗操作步驟：

a.小鼠麻醉與保定：手術前小鼠禁食12小時，用1ml注射器吸取0.3ml1％的戊巴 比妥鈉，腹腔注射到小鼠體內，然后將其保定到置有四個長釘的木板上，拉伸四肢并綁到長 釘上；

b.用剃毛刀給小鼠腹部剃毛，暴露手術視野；

c.無菌條件下，在肚臍與恥骨前緣中點向后沿腹底壁正中線切開皮膚2cm，切開腹 白線及腹膜，打開腹腔；用眼科鑷在切口下方找到子宮體右側子宮角，沿子宮角向前找到右 側卵巢，用眼科鑷輕輕固定住卵巢；

d.將直徑為1mm的硬玻璃毛細管在火焰上旋轉灼燒，使其變軟，迅速拉管從中間折 斷，使其內徑變為200μm；然后將其連接到口吸管上，毛細管一端吸取25μl轉染復合物之后 輕柔地插入卵巢9～11mm，將步驟(1)中的轉染復合物緩慢的吹入卵巢，作為實驗組；

e.用同樣的方法找到左側卵巢，將含有骨架載體的轉染復合物緩慢的吹入卵巢， 作為實驗對照組；

f.小心將卵巢還納回原始解剖位置，利用可吸收縫合線分別縫合肌肉層和皮膚， 縫合完畢后在手術切口縫合處用碘伏消毒，連續3天；

g.術后白天用保溫燈保溫，夜晚關閉，恢復小鼠正常飲食；

h.過表達效果檢測；轉染5天后，分別摘取兩側卵巢；在體視顯微鏡下分別切下兩 側卵巢的一小部分，提取組織總RNA，反轉錄成cDNA，利用qPCR檢測lncRNA的過表達水平。

步驟(1)中所述的轉染試劑為北京英格恩生物科技有限公司的EntransterTM-in vivo體內轉染試劑。

步驟(2)中所述的口吸管為硅膠軟管。

步驟(1)中所述的lncRNA重組載體通過下述方法獲得：

1).PCR引物設計：針對小鼠卵巢lncRNA的cDNA序列設計PCR引物；

2).PCR模板DNA制備：提取C57BL/6小鼠卵巢組織的總RNA并通過反轉錄得到用于PCR的cDNA模板；使用TaKaRaHSDNAPolymerase酶擴增；PCR反應結束后，取擴增產物3μl分別加入1μl5×DNAloadingbuffer于1％瓊脂糖凝膠中120V電泳，在紫外燈下觀察是否有明亮的條帶，準備PCR產物的純化；

3).PCR擴增產物純化：使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit Ver.4.0凝膠回收試劑盒進行PCR擴增產物的純化；

4)PCR擴增產物和MouseZP3promoter(JD#445骨架載體)骨架載體酶切反應：用 NEBXhoⅠ和SmaI限制性內切酶對PCR擴增產物和MOUSEZP3PROMOTER(JD#445骨架載體)骨 架載體分別進行雙酶切，酶切產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳并在紫外燈下觀察，切下目的 DNA條帶后使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0凝膠回收試 劑盒進行酶切產物回收；