[發明專利]一種卵巢原位注射實現RNA過表達的方法及應用

在審

• 申請號: 201610154665.7
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105779495A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 楊世華;李加宇;吳綺琪;方志浩;黃群山
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/113
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種卵巢原位注射實現RNA過表達的方法，其特征在于：其操作步驟如下：

(1)轉染復合物配制，包括lncRNA重組載體稀釋液和轉染試劑稀釋液：

所述的lncRNA重組載體稀釋液：

1ug/ul的lncRNA重組載體：6.25ul；

10％葡萄糖溶液3.125μl；

水3.125μl；

所述的轉染試劑稀釋液：

轉染試劑6.25μl；

10％葡萄糖溶液6.25μl；

(2)體內轉染實驗操作步驟：

a.小鼠麻醉與保定：手術前小鼠禁食12小時，用1ml注射器吸取0.3ml1％的戊巴比妥 鈉，腹腔注射到小鼠體內，然后將其保定到置有四個長釘的木板上，拉伸四肢并綁到長釘 上；

b.用剃毛刀給小鼠腹部剃毛，暴露手術視野；

c.無菌條件下，在肚臍與恥骨前緣中點向后沿腹底壁正中線切開皮膚2cm，切開腹白線 及腹膜，打開腹腔；用眼科鑷在切口下方找到子宮體右側子宮角，沿子宮角向前找到右側卵 巢，用眼科鑷輕輕固定住卵巢；

d.將直徑為1mm的硬玻璃毛細管在火焰上旋轉灼燒，使其變軟，迅速拉管從中間折斷， 使其內徑變為200μm；然后將其連接到口吸管上，毛細管一端吸取25μl轉染復合物之后輕柔 地插入卵巢9～11mm，將步驟(1)中的轉染復合物緩慢的吹入卵巢，作為實驗組；

e.用同樣的方法找到左側卵巢，將含有骨架載體的轉染復合物緩慢的吹入卵巢，作為 實驗對照組；

f.小心將卵巢還納回原始解剖位置，利用可吸收縫合線分別縫合肌肉層和皮膚，縫合 完畢后在手術切口縫合處用碘伏消毒，連續3天；

g.術后白天用保溫燈保溫，夜晚關閉，恢復小鼠正常飲食；

h.過表達效果檢測；轉染5天后，分別摘取兩側卵巢；在體視顯微鏡下分別切下兩側卵 巢的一小部分，提取組織總RNA，反轉錄成cDNA，利用qPCR檢測lncRNA的過表達水平。

2.根據權利要求1所述的卵巢原位注射實現RNA過表達的方法，其特征在于：步驟(1)中 所述的轉染試劑為北京英格恩生物科技有限公司的EntransterTM-invivo體內轉染試劑。

3.根據權利要求1所述的卵巢原位注射實現RNA過表達的方法，其特征在于：步驟(2)中 所述的口吸管為硅膠軟管。