[發(fā)明專利]表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610154335.8
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105572396B
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張金菊;王紅光
• 申請（專利權(quán)）人: 北京中科圓融生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;G01N33/80;G01N33/68;G01N33/554;C12N15/74
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 王玉松,懷春穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及納米磁珠應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體是涉及表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)菌磁顆粒是趨磁細(xì)菌生產(chǎn)的一種磁性納米顆粒，內(nèi)核是Fe₃O₄晶體，外面有一層磷脂生物膜包被，粒徑在30-120nm之間。同一種趨磁細(xì)菌生產(chǎn)的細(xì)菌磁顆粒粒徑大小和晶體晶型基本一致，磁學(xué)性質(zhì)均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性質(zhì)和膠體性質(zhì)。此外，因?yàn)榧?xì)菌磁顆粒是生物來源，因此具有較好的生物相容性。細(xì)菌磁顆粒膜上帶有大量的氨基基團(tuán)，可通過化學(xué)修飾和雙功能偶聯(lián)劑連接不同的功能大分子，如抗體，從而具有不同的獨(dú)特功能。

細(xì)菌磁顆粒最獨(dú)特的地方在于它可以通過基因工程的方法在細(xì)菌磁顆粒膜上表達(dá)特殊的蛋白質(zhì)，通過和細(xì)菌磁顆粒膜上錨定蛋白的融合表達(dá)，功能性的靶蛋白可以在細(xì)菌磁顆粒上展示出來。相比化學(xué)修飾的方法，這種生物學(xué)功能修飾的好處和優(yōu)勢更加顯而易見。因此，細(xì)菌磁顆粒作為一種新型的微生物來源納米磁珠材料，在生物醫(yī)學(xué)和納米材料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

鏈球菌蛋白G(Streptococcus Protein G,SPG)是在A、C和G群鏈球菌的細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的一種能夠和人及多種哺乳動物的IgG相結(jié)合的蛋白質(zhì)，它同IgG的親和力強(qiáng)，結(jié)合譜廣，在免疫學(xué)和免疫化學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用。重組的蛋白G去除了天然的蛋白G與其他諸如白蛋白、Fab抗體段結(jié)合的位點(diǎn)，可特異性結(jié)合IgG抗體的Fc區(qū)段。

抗人球蛋白試驗(yàn)，又稱為Coombs試驗(yàn)(庫姆試驗(yàn))，是檢測血型不規(guī)則抗體IgG的重要依據(jù)。血型抗體有IgG和IgM兩類，其中的IgM抗體在鹽水介質(zhì)中能與含相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。而IgG抗體只能致敏紅細(xì)胞，不能使其凝集，因此需要通過抗人球蛋白抗體作為第二抗體，將致敏紅細(xì)胞表面的IgG連接起來才能使得紅細(xì)胞發(fā)生凝集。在自動化檢測中，抗人球蛋白試驗(yàn)需要結(jié)合微柱凝膠卡來使用，隨著微柱凝膠卡的成本越來越高，一定程度上增加了常規(guī)試驗(yàn)和血型抗體篩查中抗人球試驗(yàn)的成本。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒及其應(yīng)用。本發(fā)明利用重組蛋白G作為第二抗體，替代抗人球試驗(yàn)中的抗人球抗體試劑；利用細(xì)菌磁顆粒的磁特性，在外加磁場的作用下可以幫助致敏紅細(xì)胞凝集，一方面最大限度減少細(xì)菌磁顆粒的使用量，另一方面最大限度提高低效價IgG抗體的檢測敏感性。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒在用于血型不規(guī)則抗體IgG的檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一方面提供一種表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒，該表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒是對趨磁細(xì)菌MSR-1重組株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、分離純化得到的。

進(jìn)一步的改進(jìn)，該重組蛋白G的序列是：

進(jìn)一步的改進(jìn)，本發(fā)明提供述趨磁細(xì)菌MSR-1重組株是通過如下方法構(gòu)建而成的：

a.構(gòu)建細(xì)菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細(xì)菌MSR-1突變株；

b.構(gòu)建細(xì)菌磁顆粒膜蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒；

c.將功能化細(xì)菌磁顆粒融合表達(dá)質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)入到步驟a制得的趨磁細(xì)菌MSR-1突變株，構(gòu)建趨磁細(xì)菌MSR-1重組株。

本發(fā)明另一方面提供一種表達(dá)重組蛋白G的細(xì)菌磁顆粒的制備方法，該方法包括如下步驟：

a.構(gòu)建細(xì)菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細(xì)菌MSR-1突變株；

b.構(gòu)建功能化細(xì)菌磁顆粒膜蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒；

c.將功能化細(xì)菌磁顆粒融合表達(dá)質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)入到步驟a制得的趨磁細(xì)菌MSR-1突變株，構(gòu)建趨磁細(xì)菌MSR-1重組株；

d.對趨磁細(xì)菌MSR-1重組株進(jìn)行培養(yǎng)；

e.分離純化，制得功能化細(xì)菌磁顆粒。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟a所述構(gòu)建細(xì)菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細(xì)菌MSR-1突變株的具體方法為：

(a)擴(kuò)增細(xì)菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因左右兩側(cè)共兩個長均為700-1000bp的同源片段；左右兩同源片段均帶有兩個酶切位點(diǎn)；

(b)左右同源片段分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；同時對自殺質(zhì)粒pKmobsacB進(jìn)行雙酶切；

(c)將經(jīng)過雙酶切后的左右同源片段和經(jīng)過雙酶切后的自殺質(zhì)粒pKmobsacB進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，挑選連接正確的陽性克隆菌；