[發明專利]水稻OsCSA基因的應用及其定點敲除方法

有效

• 申請號: 201610151129.1
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105671075B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 張大兵;袁政;李全林;梁婉琪;陳明姣;羅治靖
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

本發明提供一種水稻OsCSA基因的應用及其定點敲除方法，所述雄性不育基因CSA編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的應用具體是，采用基于CRISPR/Cas9系統敲除、改變或抑制CSA基因，使得常規水稻品種中的CSA基因表達水平降低，進而獲得水稻雄性不育株系。所述定點敲除方法為分別利用基于CH?CRISPR/Cas9系統的CC?CSA?1載體和基于Gateway?CRISPR/Cas9系統的GC?CSA?1載體對水稻雄性不育基因CSA進行定向基因編輯。本發明為創造基于水稻雄性不育基因CSA的雄性不育系種質資源、水稻兩系雜交制種提供一種高效的敲除方法和育種方式。

技術領域

本發明屬于水稻育種技術領域，涉及水稻OsCSA基因的應用及其定點敲除方法，具體地，涉及一種基于CRISPR/Cas9系統的水稻雄性不育基因CSA定點敲除方法及利用該方法在不同水稻品種中的創制雄性不育系的應用。

背景技術

雄性不育系為水稻雜交制種技術提供關鍵的育種材料，在全世界范圍內展開了廣泛的研究。水稻花粉碳饑餓(Carbon Starved Anther，csa)基因編碼一個參與水稻花藥發育和糖分配調控的R2R3MYB轉錄因子，主要在花藥絨氈層細胞和糖轉運維管組織中表達(Zhang et al,2010)。CSA基因的突變會造成水稻光敏雄性不育，表現出在短光照下雄性不育、長日照下恢復可育的特征；此外，csa不育系和恢復系JP69雜交產生的F1代具有雜種優勢(Zhang et al,2013)，因此，基于csa的光敏雄性不育系，可用于水稻兩系雜交稻制種，應用前景廣闊。

CRISPR/Cas9(成簇、規律間隔短回文重復序列及相關蛋白)系統是近幾年出現的基因組編輯新技術，在各種生物和細胞等領域都有廣泛的研究和應用。CRISPR/Cas9系統是一種源于原核生物抵御噬菌體、質粒等入侵長期進化的獲得性免疫系統，其在指導RNA下完成對外源遺傳物質的降解。CRISPR/Cas9系統的Cas9蛋白與sgRNA形成復合體，切割與sgRNA上spacer互補的基因組DNA序列，產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，激活細胞啟動DNA損傷修復機制，通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)方式引入突變。與鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系統技術具有設計簡單、構建快速、突變效率高、多把點同時編輯等優勢。

目前，水稻雄性不育系的創制主要是通過雜交將不育基因或位點導入其他水稻品種中，但是轉育周期較長、過程較復雜、勞動成本大。通過CRISPR/Cas9系統的靶向修飾直接對水稻CSA基因進行定點突變或敲除，創制基于CSA基因的水稻雄性不育株系，大大縮短育種周期。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種水稻OsCSA基因(即水稻雄性不育基因CAS)的應用及其定點敲除方法，提供了一種基于CRISPR/Cas9系統的水稻雄性不育基因CSA定點敲除方法及利用該方法在不同水稻品種中的創制雄性不育系的應用，利用CSA基因及其蛋白參與水稻花藥發育調控的特點及CRISPR/Cas9系統的基因組靶向修飾，通過突變CSA基因核苷酸序列篩選水稻雄性不育株系，在農業生產上具有十分重要的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

第一方面，本發明涉及一種水稻OsCSA基因的應用，所述OsCSA基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的應用具體是，采用基于CRISPR/Cas9系統敲除、改變或抑制CSA基因，使得常規水稻品種中的CSA基因表達水平降低，進而獲得水稻雄性不育株系。

優選地，所述CRISPR/Cas9系統為II類CRISPR/Cas9載體系統。

優選地，所述CRISPR/Cas9載體系統為：基于psgR-Cas9-Os和pCAMBIA1300載體的CH－CRISPR/Cas9構建、基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9載體的Gateway-CRISPR/Cas9構建中的一種或兩種；