[發明專利]水稻OsCSA基因的應用及其定點敲除方法

有效

• 申請號: 201610151129.1
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105671075B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 張大兵;袁政;李全林;梁婉琪;陳明姣;羅治靖
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種基于CRISPR/Cas9系統的水稻OsCSA基因的定點敲除方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系統為：基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9載體的Gateway-CRISPR/Cas9構建；

所述定點敲除方法包括如下步驟：

a)將水稻OsCSA基因靶序列CSA-1插入pOs-sgRNA載體的水稻U3啟動子下游，構建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的表達盒sgRNA-CSA-1；

b)通過gateway克隆將含有CSA-1片段的序列構建到pH-Ubi-Cas9質粒中形成GC-CSA-1質粒；

c)將含GC-CSA-1質粒的根癌農桿菌轉入水稻品種；

其中，所述靶序列CSA-1為位于SEQ ID NO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述GC-CSA-1質粒含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述水稻品種為交源5B。

2.一種水稻OsCSA基因定點敲除獲得水稻雄性不育株系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：取水稻品種交源5B，采用如權利要求1所述的方法進行處理，之后進行篩選鑒定，進而獲得水稻雄性不育株系。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述篩選為轉化植株篩選，具體包括如下步驟：通過CRISPR/Cas9系統載體自身的通用引物M13F和所述靶序列CSA-1引物的聚合酶鏈式反應擴增實現的。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述鑒定為突變植株鑒定，具體包括如下步驟：通過將OsCSA基因的特異性引物擴增OsCSA基因的基因組片段進行測序實現的。