[發明專利]一種載體蛋白His6-H4-NLS及制備方法

在審

• 申請號: 201610148480.5
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105753994A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 艾永興;吳山力;王夢云;周小露;宋敬敬;呂巖;郝林琳;于浩;張玉靜
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明提供一種載體蛋白His6-H4-NLS，可以與編碼治療性基因的表達質粒結合，作為基因治療用載體蛋白。同時還公開了該蛋白的制備方法，并應用此蛋白對腫瘤細胞進行效應研究，屬于生物工程技術領域。

背景技術

目前用于基因治療載體主要有兩大類，即病毒衍生載體和非病毒載體。

病毒載體轉染效率高，但是存在整合入人體基因組的危險及機體免疫反應，廣泛應用于臨床還需解決這些危險問題。

非病毒載體主要包括化學聚合物衍生載體和蛋白/多肽類衍生載體。目前化學聚合物衍生載體轉染效率與病毒載體相當，但是免疫原性強，機體不易降解與清除，靶向性差，限制其應用。

蛋白/多肽類載體可分成天然蛋白類與合成蛋白類。合成蛋白類載體包括多聚精氨酸、多聚組氨酸等，依靠其所帶正電荷與DNA結合，攜帶其進入細胞。這類蛋白/多肽類載體因其具有較強的免疫原性，不適于應用于臨床。另外一類源于生物體表達的天然蛋白，他們通過特定空間結構與DNA結合，攜帶這些DNA進入細胞后，載體蛋白隨著蛋白質體內降解途徑被機體降解為氨基酸后，為機體所再利用，既無細胞毒性。如果這些蛋白為生物體內高度保守的蛋白，則免疫原性低，不引起免疫反應，也不易在血漿中降解，有利于維持血漿中的濃度。再者，蛋白/多肽類載體易與功能性多肽融合而獲得諸如靶向性等優點。蛋白/多肽類載體的低毒性、低免疫原性、易獲得靶向性、開發及制備成本低等優點成為基因載體的研究熱點。

目前天然的蛋白/多肽類載體多采用組蛋白H1、組蛋白H2A、魚精蛋白等高度保守的DNA結合蛋白為核心構件，融合促進轉染的功能結構域，制備成融合蛋白。蛋白/多肽類載體的跨膜及運輸作用機制，尚不十分明確，需要制備多種不同種類的蛋白/多肽類載體，并加以研究，獲得大量實驗數據，進而闡明載體蛋白轉運的作用機制。

發明內容：

本發明提供了一種載體蛋白His6-H4-NLS，可以與編碼治療性基因的表達質粒結合，作為基因治療用載體蛋白。

本發明進一步提供了載體蛋白His6-H4-NLS的基因的獲取方法，其特點是將pET28a⁺質粒上編碼的His6的基因片段、來源于高度保守的小麥組蛋白H4基因片段與來源于猴病毒40大腫瘤抗原NLS基因片段融合。

本發明進一步提供了載體蛋白His6-H4-NLS的制備方法，具有工藝簡單、安全、無毒。

本發明提供的載體蛋白His6-H4-NLS，其氨基酸序列如下：SEQno.1。

本發明所述的載體蛋白His6-H4-NLS的基因的獲取方法，包括以下步驟：

1）提取全小麥基因組；

2）以小麥全基因組為模板設計引物，并在上游引物上添加NcoⅠ酶切位點，用于原核表達載體構建；

所用引物為：

上游引物1：

GCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCCGGGCGCGGCAAGGGAGG

上游引物2：

TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCC

下游引物1：

AGCAAGCTTATGGTTTCTTCTTTGGCTGGGGGCCGCCGAAGCCGTAGAGGGTGCG

以小麥全基因組為模板，用上游引物1和下游引物1，PCR法擴增得到小麥組蛋白H4-NLS基因序列的PCR產物；再以此PCR產物為模板，以上游引物2和下游引物1，擴增獲得編碼His6-H4-NLS基因的PCR產物；

3）將His6-H4-NLS基因序列的PCR產物用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得NcoⅠ-His6-H4-NLS-HindⅢDNA片段，將該DNA片段構建入原核表達載體pET28a中NcoⅠ和HindⅢ雙酶位點之間，獲得編碼載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達載體。

本發明所述載體蛋白His6-H4-NLS的制備方法，包括以下步驟：

1）載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達

將編碼載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達載體質粒導入到BL21（DE3）原核表達菌體系，37℃終濃度0.1mMIPTG誘導表達載體蛋白；

2）載體蛋白His6-H4-NLS原核表達產物純化