[發明專利]一種載體蛋白His6-H4-NLS及制備方法

在審

• 申請號: 201610148480.5
• 申請日: 2016-03-16
• 公開（公告）號: CN105753994A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 艾永興;吳山力;王夢云;周小露;宋敬敬;呂巖;郝林琳;于浩;張玉靜
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種載體蛋白His6-H4-NLS，其氨基酸序列如下：SEQno.1。

2.根據權利要求1所述的載體蛋白His6-H4-NLS的基因獲取方法，包括以下步驟：

1）提取全小麥基因組；

2）以小麥全基因組為模板設計引物，并在上游引物上添加NcoⅠ酶切位點，用于原核表達載體構建；

所用引物為：

上游引物1：

GCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCCGGGCGCGGCAAGGGAGG

上游引物2：

TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCC

下游引物1：

AGCAAGCTTATGGTTTCTTCTTTGGCTGGGGGCCGCCGAAGCCGTAGAGGGTGCG

以小麥全基因組為模板，用上游引物1和下游引物1，PCR法擴增得到小麥組蛋白H4-NLS基因序列的PCR產物；再以此PCR產物為模板，以上游引物2和下游引物1，擴增獲得編碼His6-H4-NLS基因的PCR產物；

3）將編碼載體蛋白His6-H4-NLS基因序列的PCR產物用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得NcoⅠ-His6-H4-NLS-HindⅢDNA片段，將該DNA片段構建入原核表達載體pET28a⁺中NcoⅠ和HindⅢ雙酶位點之間，獲得編碼載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達載體。

3.權利要求1所述載體蛋白His6-H4-NLS的制備方法，包括以下步驟：

1）載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達

將權利要求2中所獲得的載體蛋白His6-H4-NLS的原核表達載體質粒導入到BL21（DE3）原核表達菌體系，37℃終濃度0.1mMIPTG誘導表達載體蛋白；

2）載體蛋白His6-H4-NLS原核表達產物純化

變性條件下，Ni親和層析一步法純化步驟1）獲得的載體蛋白His6-H4-NLS，透析后分裝凍存即得。

4.權利要求1所述的載體蛋白His6-H4-NLS的活性鑒定方法，包括以下步驟：

1）根據SDS-PAGE分析的純度；

2）凝膠阻滯實驗，確定不同N/P條件下，載體蛋白His6-H4-NLS與DNA結合形成的復合物結合能力特性；

3）利用載體蛋白His6-H4-NLS分別攜帶編碼熒光素酶質粒Luc-pVAX1，對乳腺癌細胞系MCF-7進行轉染，通過熒光分光光度儀檢測，獲得轉染效率結果。