[發明專利]一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法

有效

• 申請號: 201610148263.6
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105647864B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 徐以兵;鄭樹;梁廷波;朱莉莉;胡薇蕾
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00;A61P3/10;A61P43/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發明公開了一種使用轉染功能蛋白質的宿主細胞,聯合多種蛋白質擴增激活iNKT淋巴細胞的方法。本發明的優點是與現有的方法相比，本發明擴增和激活的iNKT細胞的純度更高、擴增效率更高、殺傷腫瘤和腫瘤微環境中TAMs的能力更強。本發明在控制和緩解部分疾病的進展,如腫瘤、糖尿病及器官移植的排斥方面具有廣闊的前景。

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體是指使用轉染了多種蛋白質的宿主細胞，聯合多種蛋白共同作用定向擴增激活iNKT細胞的方法。

背景技術

iNKT細胞治療對多種腫瘤例如：肺癌、頭部和頸部鱗狀細胞癌、肉瘤癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前iNKT細胞治療在美國主要用來和手術、化療和放療聯合使用解決腫瘤的復發問題。iNKT細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得大量高純度的iNKT細胞非常困難。傳統使用的白介素2聯合α-半乳糖神經酰胺擴增生長的倍數有限(平均100倍)；純度低(20％-30％)；擴增后的iNKT細胞殺傷功能低下，不能滿足臨床需求。本發明人之前的發明采用轉染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L蛋白質的K562細胞(以下簡稱宿主細胞)用于擴增NK細胞。本發明將宿主細胞結合傳統使用的α-半乳糖神經酰胺和白介素2定向擴增激活iNKT細胞，解決了iNKT數量和純度的問題，能夠充分滿足臨床治療的需求。

發明內容

本發明針對現有技術中的不足，提出一種更加有效的iNKT淋巴細胞的擴增激活方法。

本發明是通過下述技術方案得以實現的：一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合蛋白質A1、α-半乳糖神經酰胺共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到iNKT淋巴細胞；所述蛋白質A包含CD8α的完整片段和白介素21的功能片段；蛋白質B包含CD14的功能片段；蛋白質C包含CD19的功能片段；蛋白質D包含CD86的功能片段；蛋白質E包含CD163的功能片段；蛋白質F包含CD137L的功能片段；蛋白質A1包含白介素2的功能片段。

進一步地，所述宿主細胞為K562細胞。

進一步地，所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM-1000pM。蛋白質A1和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞：淋巴細胞＝1-10：1，更優選地，為宿主細胞：淋巴細胞＝1-4：1，最優選地為1∶1。

進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質A1為純化的蛋白質；所述純化是指質量分數在90％以上。

進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F分別為CD8α-白介素21復合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8α為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，CD8α連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、CD19、CD86和CD137L均為膜蛋白。

進一步地，所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的淋巴細胞。

進一步地，轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞通過蛋白穩定表達系統得到。

進一步地，所述方法包括：