[發明專利]一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法

有效

• 申請號: 201610148263.6
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105647864B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 徐以兵;鄭樹;梁廷波;朱莉莉;胡薇蕾
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00;A61P3/10;A61P43/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法，其特征在于，使用轉染了CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L的K562細胞，聯合白介素2、α-半乳糖神經酰胺共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到iNKT淋巴細胞；具體步驟為：

（1）對轉染了CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L的K562細胞進行輻照致死處理；

（2）在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟（1）處理后的K562細胞、以及白介素2、α-半乳糖神經酰胺共同培養7天；所述的CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L的量均為50pM-1000pM；白介素2和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升；

（3）經培養后，輻照后的K562細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；

（4）加入輻照處理后的K562細胞培養7天；經培養后，輻照后的K562細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到iNKT淋巴細胞；

其中，所述培養液由100體積的1640培養液和10體積的胎牛血清組成。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述K562細胞與淋巴細胞的數量比為K562細胞：淋巴細胞=1-10：1。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述K562細胞與淋巴細胞的數量比為K562細胞：淋巴細胞=1-4：1。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述K562細胞與淋巴細胞的數量比為K562細胞：淋巴細胞=1∶1。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L由K562細胞在細胞膜表面即時表達，白介素2為純化的蛋白質；所述純化是指質量分數在90%以上。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD8α-白介素21中，CD8α為在K562細胞膜上表達的膜蛋白，CD8α 連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、CD19、CD86 和CD137 L均為膜蛋白。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的淋巴細胞。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，轉染了CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L的K562細胞是蛋白穩定表達系統。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述輻照的劑量為100Gy-1000Gy。