[發(fā)明專利]一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的基因組DNA提取方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610147895.0
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105734050A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 岳巧云;單振菊;邱德義;陳健;吳可量;劉德星;魏曉雅
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于基因組DNA提取領(lǐng)域，具體涉及一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的基因組DNA提取方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

土壤甲螨等是小型節(jié)肢動物，個體通常小于1mm，這種小型節(jié)肢動物的鑒定一般是通過對其制作玻片標本后進行鑒定，這種方法專業(yè)性強，鑒定難度大，隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，幾乎所有主要的動物類群都在構(gòu)建所選擇基因區(qū)域(如COⅠ)的綜合序列數(shù)據(jù)庫，并建立相應(yīng)的憑證標本館藏。

根據(jù)常規(guī)的DNA提取方法，獲得小型節(jié)肢動物的DNA條碼需要對整個個體進行研磨，從而破壞了小型節(jié)肢動物個體的形態(tài)，造成憑證標本不能保存或不能完整的保存，如果將幾個甚至幾十個個體混在一起，又很難保證DNA模板來源的單一性，為后續(xù)的結(jié)果分析帶來很大的麻煩。近來，越來越多的學者也在不斷摸索針對微小節(jié)肢動物個體的新的DNA條碼獲取方法，有些報道通過將微小節(jié)肢動物個體整只進行裂解，以獲得DNA條碼并達到憑證標本不被破壞的目的，但是很多微小節(jié)肢動物個體具有很厚的幾丁質(zhì)保護殼，例如土壤甲螨，如果不研磨，只通過裂解液很難獲得足夠濃度的DNA模板。目前，具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的DNA條碼獲得方法相關(guān)發(fā)明未見公布，因此很有必要研究一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的DNA條碼獲得方法和試劑盒。

幾丁質(zhì)酶的作用是降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，以往的研究中，大多數(shù)都是對幾丁質(zhì)酶的基因結(jié)構(gòu)、幾丁質(zhì)酶在植物病害防治中的作用或利用幾丁質(zhì)酶測定活性等方面的研究，未發(fā)現(xiàn)有利用幾丁質(zhì)酶消化小型節(jié)肢動物幾丁質(zhì)殼并用于基因組DNA提取的報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的基因組DNA提取方法和試劑盒，利用該方法既能獲得較高質(zhì)量DNA模板和保證模板DNA的單一來源性又能保證憑證標本不被破壞，同時與以往的形態(tài)鑒定相比能大大減少對形態(tài)專家的依賴性，減少主觀性，提高鑒定的準確性。

本發(fā)明的具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的基因組DNA提取方法，其特征在于，將具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物用幾丁質(zhì)酶處理后，然后加入裂解液中裂解后，獲得基因組DNA。

優(yōu)選，所述的裂解液為：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、質(zhì)量分數(shù)0.5％TritonX-100、質(zhì)量分數(shù)5％Tween-20，溶劑為水。

優(yōu)選，是將具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物放置于含1mg/ml幾丁質(zhì)酶的pH6.0磷酸緩沖液中，25℃消化24小時，然后將消化后的具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物放置于裂解液中，56℃裂解24h，獲得基因組DNA，所述的裂解液為：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、質(zhì)量分數(shù)0.5％TritonX-100、質(zhì)量分數(shù)5％Tween-20，溶劑為水。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動物無損傷憑證標本的基因組DNA提取試劑盒，包括DNA提取試劑，其特征在于，還包含幾丁質(zhì)酶工作液和裂解液。

優(yōu)選，所述的裂解液為：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、質(zhì)量分數(shù)0.5％TritonX-100、質(zhì)量分數(shù)5％Tween-20，溶劑為水。

優(yōu)選，所述的幾丁質(zhì)酶工作液是含1mg/ml幾丁質(zhì)酶的pH6.0磷酸緩沖液，所述的裂解液為：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、質(zhì)量分數(shù)0.5％TritonX-100、質(zhì)量分數(shù)5％Tween-20，溶劑為水。

所述的DNA提取試劑盒中優(yōu)選還包括洗液A(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中GD)，洗液B(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中PW)、正向引物LCO14905’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’、反向引物HCO21985’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’、dNTP、含Mg²⁺的10×Buffer和Taq酶。

利用本發(fā)明的方法和試劑盒可以既能獲得較高質(zhì)量DNA模板和保證模板DNA的單一來源性又能保證憑證標本不被破壞，同時與以往的形態(tài)鑒定相比減少對形態(tài)專家的依賴性，減少主觀性，提高鑒定的準確性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明：